淀粉酶广泛应用于淀粉加工、食品、医药、发酵、饲料等领域，是目前应用较多、产量较大的酶类之一[1]。地衣芽孢杆菌能够调节动物肠道环境，可应用于环境保护、农业、化工业、医药、基因工程[2-4]等领域。地衣芽孢杆菌所产酶系非常丰富，包括蛋白酶[5]、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶[6]、葡聚糖酶、纤维素酶[7]等。本试验研究地衣芽孢杆菌的生长曲线、耐受性和抑菌特性进，优化其产淀粉酶的条件，为其在饲料添加剂领域的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料地衣芽孢杆菌浓度为108 CFU/mL（河北省水产养殖微生物菌剂技术创新中心）；大肠杆菌浓度为107 CFU/mL、沙门氏菌浓度为106 CFU/mL、金黄色葡萄球菌浓度为107 CFU/mL（实验室）。酒糟、麸皮由河北省水产养殖微生物菌剂技术创新中心提供。1.2试剂、培养基与仪器磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、麦芽糖、葡萄糖、纤维素、硝酸铵由沧州建新化工生物有限公司提供。本试验主要配置基础培养基、LB液体培养基、初始发酵培养基，基本配方见文献[8]。CMC培养基、可溶性淀粉琼脂培养基、蛋白酶培养基的基本配方见文献[9]和文献[10]。脂肪酶培养基、β-葡聚糖酶培养基的基本配方见文献[11]和文献[12]。超净工作台（苏州净化设备有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（杭州百奥科学仪器有限公司）、紫外分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1生长曲线测定将保存在甘油管中的地衣芽孢杆菌使用基础培养基活化，接种于LB培养基中，30 ℃、180 r/min培养。按照文献[12]方法测定吸光度，每隔4 h测定，直至数值稳定。1.3.2耐受性[13]1.3.2.1耐酸性取100 μL培养的菌液接种于不同pH值的LB培养基中，pH值分别为4、5、6、7，培养24 h。按照文献[14]进行吸光度的测定。1.3.2.2耐碱性取100 μL培养的菌液接种于不同pH值的LB培养基中，pH值分别为7、8、9、10，培养24 h。按照文献[15]进行吸光度的测定。1.3.2.3耐盐性取100 μL培养的菌液接种于不同盐浓度的LB培养基中，盐浓度分别为2%、4%、6%、8%和10%，培养24 h。按照文献[16]进行吸光度的测定。1.3.3抑菌活性采用打孔法，以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌种，在平板上分别打3个孔，以生理盐水作为对照，37 ℃培养24 h。1.3.4产酶条件优化1.3.4.1产酶体系研究采用透明圈法研究菌株产淀粉酶、葡聚糖酶特性；采用显色法研究菌产蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶特性。1.3.4.2产淀粉酶单因素试验优化分别对装液量、培养时间、碳源种类、氮源种类、pH值、碳源添加量、氮源添加量进行单因素试验设计。单因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T001表1单因素水平设计水平装液量/mL培养时间/h氮源碳源pH值碳源添加量/%氮源添加量/%15012牛肉膏麦芽糖5.50.500.5027518酒糟玉米粉6.00.750.75310024酵母粉麸皮6.51.001.00412530酪蛋白葡萄糖7.01.251.25515036硝酸铵纤维素7.51.501.501.3.4.3产淀粉酶响应面试验优化（1）Plackett-Burman试验设计。在单因素条件的基础上，采用PB法，筛选最显著的因素点。其中，B、D、F、H、I、K、L为空项，设置11组。Plackett-Burman水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T002表2Plackett-Burman水平设计编号因素水平-11A碳源添加量/%0.51.5B空项-11C氮源添加量/%0.51.5D空项-11EpH值5.57.5F空项-11G装液量/mL50150H空项-11I空项-11J空项-11K培养时间/h1236L空项-11（2）最陡爬坡试验。PB试验的基础上进一步设计最陡爬坡的试验，响应面试验只有在临近最佳值时才能建立有效的响应面方程，通过最陡爬坡试验确定显著因素的最适水平点。最陡爬坡试验水平设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T003表3最陡爬坡试验因素水平设计水平碳源添加量（A）/%装液量（G）/mL氮源添加量（C）/%11.501501.5021.251251.2531.001001.0040.75750.7550.50500.50（3）Box－Behnken试验设计。综合单因素、PB和最陡爬坡试验结果，选择影响较大的3因素作为响应面分析因素。响应面水平设计见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T004表4响应面试验因素水平设计水平碳源添加量（A）/%装液量（G）/mL氮源添加量（C）/%-11.251251.2501.001001.0010.75750.75（4）酶活的检测。采用淀粉-碘比色法，方法参考文献[17]。2结果与分析2.1地衣芽孢杆菌的生长曲线（见图1）由图1可知，随着培养时间延长，地衣芽孢杆菌的对数生长期为4~12 h；12~40 h，菌株生长趋于稳定；40 h以后，菌株基本处于衰亡期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F001图1地衣芽孢杆菌的生长曲线2.2耐受性试验2.2.1地衣芽孢杆菌的耐酸性结果（见图2）由图2可知，pH值为6时，吸光度达到顶峰；随着pH值进一步提高，吸光度呈现下降趋势；pH值为4时，吸光度基本为零，环境过酸导致菌死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F002图2地衣芽孢杆菌耐酸性结果2.2.2地衣芽孢杆菌的耐碱性结果（见图3）由图3可知，随着pH值进一步增加，地衣芽孢杆菌的吸光度逐渐降低，吸光度最高点的pH值为6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F003图3地衣芽孢杆菌的耐碱性结果2.2.3地衣芽孢杆菌的耐盐性结果（见图4）由图4可知，随着盐浓度增加，地衣芽孢杆菌的吸光度呈增长趋势，但趋势较小。盐浓度为2%时，吸光度最大；盐浓度大于4%，吸光度开始急速下降；盐浓度为8%时，吸光值基本为0，菌体裂解死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F004图4地衣芽孢杆菌的耐盐性结果2.3地衣芽孢杆菌的抑菌性结果（见图5~图7）由图5~图7可知，3个培养皿未出现明显的抑菌圈，地衣芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌无抑菌性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F005图5地衣芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的抑菌性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F006图6地衣芽孢杆菌对沙门氏菌的抑菌性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F007图7地衣芽孢杆菌对大肠杆菌的抑菌性2.4产酶条件优化结果2.4.1产酶体系研究（见图8~图12）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F008图8脂肪酶培养基10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F009图9蛋白酶培养基10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F010图10淀粉酶培养基10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F011图11葡聚糖酶培养基由图8、图9可知，地衣芽孢杆菌产脂肪酶、蛋白酶，可通过显色的深浅及时间确定其产酶的多少，地衣芽孢杆菌产蛋白酶的能力大于产脂肪酶。由图10~图12可知，地衣芽孢杆菌基本不产纤维素酶，通过比较透明圈的直径确定其产淀粉酶的能力大于产葡聚糖的能力。因此，地衣芽孢杆菌产淀粉酶较丰富，确定后期试验的优化酶系为淀粉酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F012图12纤维素酶培养基2.4.2产淀粉酶单因素试验优化结果2.4.2.1碳源种类对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图13）由图13可知，碳源对地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力的影响较大，添加麸皮时地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力最高，添加玉米粉时活力最低，故确定麸皮为最佳碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F013图13碳源种类对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.2.2氮源种类对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图14）由图14可知，氮源种类对地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力具有较大影响。其中，添加牛肉膏时，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力最高，酵母粉时活力最低。因此，确定最佳氮源为牛肉膏。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F014图14氮源种类对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.2.3碳源添加量对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图15）由图15可知，随着麸皮添加量逐渐增大，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力呈先增加后降低的趋势，麸皮添加量为1%时酶活力最强。因此，选取1%为碳源最优添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F015图15碳源添加量对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.2.4氮源添加量对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图16）由图16可知，随着氮源添加量增加，酶活力呈现先增加后下降的趋势，在氮源添加量为1%时达到最高。因此，选取1%为最优氮源添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F016图16氮源添加量对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.2.5pH值对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图17）由图17可知，随着pH值逐渐增大，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力呈先下降后上升最后下降的状态，pH值为6.5时，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活较高。因此，确定最佳pH值为6.5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F017图17pH值对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.2.6装液量对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图18）由图18可知，随着装液量逐渐增大，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力呈先降低后急速增加最后降低的状态，装液量为100 mL时酶活力最大。本试验为小试培养，锥形瓶容积为250 mL，可能导致溶氧不足，使淀粉酶活力在125 mL时急速下降。因此，确定100 mL为最佳装液量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F018图18装液量对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.2.7培养时间对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响（见图19）由图19可知，随着培养时间延长，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力呈先下降后上升最后下降的状态，其中培养24 h时产淀粉酶活较高，故确定最佳培养时间为24 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F019图19培养时间对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的影响2.4.3产淀粉酶响应面试验优化结果2.4.3.1Plackett－Burman试验结果（见表5、表6）由表6可知，对地衣芽孢杆菌产淀粉酶影响显著的3个因素依次是AGC，即麸皮添加量装液量牛肉膏添加量，确定这3个因素为试验的关键因素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T005表5Plackett-Buran试验结果序号ABCDEFGHIJKL酶活/(U/L)11.510.517.5150-1-1-136-15 46620.511.515.5-15011-13616 31130.510.517.5-115011112-17 77741.5-11.517.5-150-1-111212 04451.5-10.5-17.5-115011-13613 91161.5-11.515.5115011-112-11 91170.5-10.5-15.5-150-1-1-112-17 37781.511.5-15.5-1150-1-1136-17 64490.511.5-17.51150-1-1-11217 200100.5-11.5-17.515011136-14 844111.510.5-15.51501111217 866120.5-10.515.51150-1-113612 26610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T006表6Plackett－Burman试验分析结果序号P值效应值重要性排序A0.010-1 155.5001C0.323-784.8333E0.332-355.5004G0.265-533.1672K0.337-622.16752.4.3.2最陡爬坡路径试验结果（见表7）麸皮添加量、装液量、牛肉膏添加量3个因素均为负效应，设计最陡爬坡试验以确定该因素的中心值。由表7可知，随着麸皮添加量、装液量、牛肉膏添加量逐渐减小，淀粉酶活力呈先增大后减小的趋势。其中，当麸皮添加量为1.00%、装液量为100 mL、牛肉膏添加量为1.00%时，淀粉酶活力最大。因此，以表7中序号3的因素水平为中心值设计后续响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T007表7最陡爬坡路径试验结果序号碳源添加量（A）/%装液量（G）/mL氮源添加量（C）/%酶活/(U/L)11.501501.502 35521.251251.253 82231.001001.004 31140.75750.753 91150.50500.502 7552.4.3.3Box-Benhnken响应面试验结果（见表8）由表8可知，17组试验对应的淀粉酶活性。使用Design-Expert 8.0.7.1软件获得的数据进行多变量回归拟合，以测定的淀粉酶活力为响应值（Y），独立变量分别为装液量、牛肉膏添加量和麸皮添加量，得到回归方程式：Y=-28 750+30 390A+392.97B+8 847C+12.4AB+184AC+65.28BC-17 024A2-2.366 4×B2-9 632×C2（R2=0.946 5），方程具有良好的拟合，测试误差相对较小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T008表8Box-Benhnken响应面试验结果试验号碳源添加量（A）/%装液量（G）/mL氮源添加量（C）/%酶活/(U/L)11.001001.007 89221.001001.007 60031.251000.756 37740.751000.757 36851.001250.755 48860.751251.005 46671.00751.254 36681.251001.254 15590.75751.005 546101.001251.254 844111.001001.007 111121.251251.004 355131.25751.004 125141.001001.007 822151.001001.006 655161.00750.756 642170.751001.255 100由表9可知，响应面模型P=0.001 1，小于0.05，具有显著影响；从单因素效应分析，A、C对淀粉酶活性的影响显著或极显著，本模型中，B2对结果的影响差异极显著（P0.01），A2、C2对结果的影响差异显著（P0.05）。各因素间测试的准确性通常由分散系数（CV）表示。本试验CV值为0.078 9，相对较小，信噪比值（AP）为9.3254，反应外部干扰对试验模型的影响程度，AP4表明模型受干扰程度小，获得的二次回归方程可以很好地预测响应面。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T009表9响应面模型和回归系列显著性检验项目平方和自由度均方F值P值显著性模型2.777×10793.015×10613.750 00.001 1*A2.495×10612.495×10611.380 00.011 9*B34 584.50134 584.500.157 70.703 1C6.864×10616.864×10631.300 00.000 8**AB24 025.00124 025.0000.109 50.750 3AC529.001529.0000.002 40.962 2BC6.659×10516.659×1053.040 00.125 0A²4.767×10614.767×10621.730 00.002 3*B²9.210×10619.210×10642.000 00.000 3**C²1.526×10611.526×1066.960 00.033 5*残差1.535×10672.193×105失拟项4.378×10531.459×1050.531 90.684 4纯误差1.097×10642.744×105校正总和2.867×10716注：“**”表示影响极显著（P0.01）；“*”表示影响显著（P0.05）。使用Design-Expert 8.0.7.1软件对数据进行分析，获得二次响应面回归模型。各因素对淀粉酶活力的交互作用见图20~图22。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F020图20装液量和麸皮添加量对产酶量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F021图21麸皮添加量和牛肉膏添加量对产酶量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.F022图22装液量和牛肉膏添加量对产酶量的影响由图20~图22可知，装液量一定时，淀粉酶活力随麸皮添加量的增加呈先增加后降低的趋势，在1.0%时达到最大值；牛肉膏添加量一定时，淀粉酶活力随装液量的增加呈先增加后降低的趋势，在100 mL时达到最大值；麸皮添加量一定时，淀粉酶活力随牛肉膏添加量的增加呈先增加后降低的趋势，在1.0%时达到最大值。各因素的最佳值分别为装液量96.44 mL、麸皮添加量0.932%、牛肉膏添加量0.795%，最大产酶量为7 876.51 U/L。2.5响应面模型拟合与试验验证（见表10）为了验证优化模型下的预测值是否真实有效，以响应面优化预测为基础，验证该菌株产生淀粉酶的能力。由表10可知，最优条件下，地衣芽孢杆菌产淀粉酶活性平均为7 866 U/L，与响应面优化的预测值7 876.51 U/L很接近，拟合度达99%，表明响应面优化模型可靠，能够较好地对优化条件下地衣芽孢杆菌所产淀粉酶活性进行预测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.016.T010表10验证试验设计与结果序号碳源添加量（A）/%装液量（G）/mL氮源添加量（C）/%酶活/(U/L)11.00960.807 93321.00960.807 95531.00960.807 7113结论本试验对地衣芽孢杆菌的基本性能进行研究，发现地衣芽孢杆菌的对数生长期为4~12 h，pH值为4时的生长状态最差，pH值为6时的生长状态最好；盐浓度大于8%时，菌基本不生长，盐浓度2%时，菌的生长状态最佳；地衣芽孢杆菌产淀粉酶活力大于产蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶、脂肪酶的能力。通过单因素试验、PB试验、最陡爬坡试验和响应面试验对地衣芽孢杆菌产淀粉酶的碳氮源添加量、培养时间、培养基的pH值以及装液量进行优化，得到的最佳培养条件为牛肉膏添加量0.80%、麸皮添加量1.00%、培养时间24 h、pH值6.5、装液量97 mL，得到淀粉酶活力为7 866 U/L，与初始培养条件下的淀粉酶活力（4 866 U/L）相比，优化后的淀粉酶活力提高1.6倍，产淀粉酶能力显著提升，为地衣芽孢杆菌的进一步研究和开发提供参考。