猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）为一种连环体线状双链DNA病毒[1]，属于疱疹病毒科的疱疹病毒属。猪是PRV的天然宿主及贮存宿主，各阶段的猪均易感，主要临床表现为两周龄内的仔猪死亡、呼吸系统综合征、炎症和多器官衰竭以及母猪流产不育等。研究发现，PRV能够使机体免疫细胞死亡[2]，引起免疫抑制，介导炎症发生，损害器官[3]。目前，猪伪狂犬病无特效的治疗药物，通常采取疫苗免疫预防。但2011年以来，许多地区猪群中出现致病性增强的新型PRV变异株[4]，现有伪狂犬病活疫苗的保护效果不太理想。中草药具有抗病毒、抗炎、增强免疫等功能[5-6]。辣蓼（Polygonum hydropiper L.）是在我国分布广泛的一种具有重要经济价值的中草药。辣蓼草中主要含有芦丁、槲皮素、金丝桃苷、槲皮苷等黄酮类化合物[7-8]。黄酮类化合物是传统中草药中常见的活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫力、抗应激、抗炎以及抗肿瘤等作用[9-10]。植物黄酮类化合物具有生理活性强、毒副作用低的优势，在医药领域具有广阔的应用前景和潜在的开发利用价值[11]。本试验将不同浓度的槲皮苷（QUE）及金丝桃苷（HYP）分别与PRV感染的3D4/2细胞共孵育，检测不同时间点细胞上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌水平变化，探讨辣蓼黄酮有效成分HYP和QUE对PRV体外感染3D4/2细胞诱导的炎性因子分泌水平的调节作用，为辣蓼在猪的病毒性疾病的应用提供参考。1材料与方法1.1主要试剂DMEM高糖培养基及新生胎牛血清均购自Gibco公司；L-谷氨酰胺、二甲基亚砜（DMSO）、青链霉素混合液、0.25%胰酶消化液均购自北京索莱宝生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。1.2细胞株与毒株细胞：猪肺泡巨噬细胞系3D4/2细胞由广西大学动物科技学院预防兽医实验室提供；猪肾细胞系PK-15细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。病毒：PRV-GXLB-2013株由广西大学动物科学技术学院预防兽医学实验室分离鉴定，由广西大学兽医药理实验室在PK-15细胞上扩增培养获得病毒液，-80 ℃冻存。1.3试验药物QUE标准品（批号111538-201606）、HYP标准品（批号111521-201809）、芦丁标准品（批号100080-201811），均购自国家药品标准物质中心。1.4测定指标及方法1.4.1CCK8法检测QUE和HYP对3D4/2细胞活性的影响将1.0 g QUE和HYP分别使用100 μL DMSO溶解，加入含5% FBS的DMEM细胞维持液将药物配制为10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560 μmol/L（DMSO终浓度不超过0.5%）。3D4/2细胞传代培养，调整浓度为5×104个/mL的细胞悬液，按照100 μL/孔加至96孔板。试验分别设置空白对照组、细胞对照组和不同浓度的QUE、HYP药物组，每组6个重复。于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养至细胞贴壁生长80%，弃去板中培养上清液，使用无菌PBS润洗2次，药物组分别加入100 μL对应浓度的药物，细胞对照组和空白对照组加入等量的细胞维持液。在培养箱中孵育8、12、24、48 h。培养结束前2 h，弃去板中培养上清液，使用无菌PBS洗涤2次，每孔加入含10% CCK8的细胞维持液，在培养箱中封口孵育2 h，使用酶标仪测定450 nm处的吸光度。细胞病变率为10%时对应的药浓度即为最大安全浓度。细胞存活率=(药物组OD值-空白对照组OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照组OD值)×100%(1)1.4.2PRV病毒毒价将5×103个/mL的PK-15细胞接种于96孔板，每孔100 μL，分别设置空白对照组和不同浓度的病毒组；将细胞于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养至细胞贴壁铺满90%，弃去培养上清，无菌PBS洗2次，使用DMEM将病毒液梯度稀释为原液的10-1~10-9倍，每个浓度设7个重复，100 μL/孔，空白对照组加入同等体积的无血清DMEM培养基。将96孔板封口置于恒温培养箱中使病毒充分吸附，每20 min摇匀1次，1 h后弃病毒液，无菌PBS洗涤3遍，每孔贴壁加入200 μL的细胞维持液，封口于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养；每天观察并记录细胞病变（CPE）状况，直至试验中最高稀释度的病毒组不再出现细胞病变，根据Reed-Muench法计算病毒滴度。1.4.3QUE和HYP对炎症相关因子分泌水平的影响在前期试验的基础上，设高中低药物处理组、芦丁药物对照组、PRV对照组和细胞对照组。将1×105个/mL的3D4/2细胞200 μL/孔铺于96孔板中，细胞完全贴壁后，弃去上清液，使用无菌PBS洗涤3次。药物处理组、芦丁药物对照组和PRV对照组加入102 TCID50的病毒液，细胞对照组加入无血清DMEM培养基，100 μL/孔。封口置于5% CO2，37 ℃恒温培养箱孵育，每隔20 min摇匀1次，吸附病毒1 h，吸弃病毒液，PBS洗涤3次，将药物处理组分别加入浓度为160、40、10 μmol/L的QUE和浓度为40、20、10 μmol/L的HYP；芦丁药物对照组加入浓度为70 μmol/L的芦丁药物稀释液；PRV对照组和细胞对照组加入细胞维持液，每孔200 μL，每组7个重复。置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱，于第8、12、24、48 h分别收集细胞上清液，-80 ℃冻存，用于细胞因子检测。取细胞上清液，按照ELISA检测试剂盒操作说明，检测细胞上清液中的IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平。1.5数据统计与分析数据采用SPSS 23.0单因素方差分析显著性，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1HYP和QUE对3D4/2细胞活力的影响（见表1、表2）由表1可知，与细胞对照组相比，10~40 μmol/L的HYP对3D4/2细胞活性无抑制作用。320、640、1 280、2 560 μmol/L的HYP处理3D4/2细胞后，随着药物处理时间增加及药物浓度的增大细胞活性逐渐下降且低于细胞对照组。与细胞对照组相比，20、40 μmol/L药物处理48 h时，处理组对细胞活性具有极显著促进作用（P0.01）；10 μmol/L组在24 h时对细胞活性具有显著促进作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.018.T001表1HYP对3D4/2细胞活力的影响组别8 h12 h24 h48 h细胞对照组100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.0010 μmol/L组100.06±0.30100.81±0.91104.54±0.02a105.67±0.8320 μmol/L组100.71±0.53100.04±0.53103.23±0.31109.34±0.06A40 μmol/L组100.67±0.94100.01±0.33103.48±0.02117.57±0.03A80 μmol/L组86.39±0.33A98.19±0.96a98.85±0.59118.58±0.03A160 μmol/L组80.56±0.22A94.90±0.65A94.72±0.67a109.91±0.03A320 μmol/L组73.32±0.62A89.78±0.97A96.21±0.0293.21±0.01a640 μmol/L组74.16±0.38A85.94±0.01A84.85±0.45A97.66±0.081 280 μmol/L组73.57±0.16A83.42±0.01A72.33±0.57A90.02±0.02A2 560 μmol/L组64.05±0.62A80.13±0.55A68.83±0.07A78.36±0.01A注：同列数据肩标小写字母表示与对照组相比差异显著（P0.05），大写字母表示与对照组相比差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%由表2可知，与细胞对照组相比，10~160 μmol/L的QUE对3D4/2细胞活性无抑制作用。320、640、1 280、2 560 μmol/L的QUE处理3D4/2细胞后，随着药物处理时间增加所有时间点的细胞活性逐渐下降且细胞活性均低于细胞对照组。与细胞对照组相比，10 μmol/L的QUE组对3D4/2细胞活性在24 h时对细胞活性具有极显著促进作用（P0.01）；80 μmol/L的QUE组在12 h时对细胞活性具有极显著促进作用（P0.01）；160 μmol/L 组在12 h时对细胞活性具有显著的促进作用（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.018.T002表2QUE对3D4/2细胞活力的影响组别8 h12 h24 h48 h细胞对照组100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.0010 μmol/L组110.33±0.09120.56±0.10107.12±0.02A100.49±0.6520 μmol/L组105.98±0.07124.36±0.13a101.76±0.02100.75±0.4740 μmol/L组108.59±0.07124.43±0.13a100.81±0.02100.69±0.5780 μmol/L组112.35±0.11135.76±0.16A101.64±0.03100.83±0.01160 μmol/L组100.61±0.12126.79±0.17a102.84±0.03104.90±0.02320 μmol/L组93.55±0.12124.92±0.14a96.44±0.03106.24±0.01A640 μmol/L组82.91±0.08a111.87±0.1386.98±0.02A95.28±0.02A1 280 μmol/L组69.62±0.07A90.47±0.6068.92±0.01A73.07±0.01A2 560 μmol/L组51.93±0.04A50.84±0.19A43.72±0.01A49.44±0.01A%通过显微镜下观察各试验组细胞状态发现，在160 μmol/L以上浓度的QUE及40 μmol/L以上浓度的HYP的处理组中发现明显的细胞病变，细胞间隙变大、拉丝、聚团、变圆、贴壁不牢；细胞核碎裂，培养液中出现细胞碎片，且随药物浓度的升高细胞病变增多。联合CPE情况，最终选取QUE浓度为160、40、10 μmol/L，HYP浓度为40、20、10 μmol/L作为后续试验的药物浓度。2.2病毒TCID50测定结果PRV感染3D4/2细胞后出现的细胞病变见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.018.F001图1PRV感染3D4/2细胞后出现的细胞病变由图1可知，PRV感染3D4/2细胞后细胞变圆，折光性增强，出现典型CPE。根据Reed-Muench 方法计算PRV-GXLB-2013第3代细胞传代培养物在3D4/2细胞中的TCID50为10-7/0.1 mL。2.3QUE和HYP对PRV感染3D4/2细胞炎症因子分泌水平测定结果2.3.1两种有效成分对PRV感染3D4/2细胞中IL-1β分泌水平的影响（见表3）由表3可知，与细胞对照组相比，PRV感染引起了3D4/2细胞内IL-1β的水平升高，在所有时间点均显著升高（P0.05）。与PRV组相比，PRV+QUE40组在8 h和12 h 3D4/2细胞IL-1β分泌水平显著降低（P0.05），在24 h 3D4/2细胞的IL-1β水平极显著降低（P0.01）；12、24 h，PRV+HYP20组的3D4/2细胞内的IL-1β分泌水平显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.018.T003表 3两种有效成分对PRV感染3D4/2细胞IL-1β水平的影响组别8 h12 h24 h48 h细胞对照组43.15±1.2544.09±3.1047.42±10.1135.87±3.54PRV组50.90±4.44a52.43±6.11a63.61±2.26a53.41±6.25aPRV+HYP10组62.14±11.71b51.20±5.4564.9±13.9356.11±5.82bPRV+HYP20组47.41±5.7543.10±4.01b43.03±3.46b38.40±7.56PRV+HYP40组57.58±4.9845.76±4.9149.33±3.8751.62±10.13bPRV+QUE10组54.25±6.3849.80±9.6457.61±8.5262.08±11.08PRV+QUE40组40.59±4.00b42.38±5.46b40.06±5.52B47.21±9.20PRV+QUE160组53.63±9.0847.93±3.2949.71±4.8350.08±6.58PRV+芦丁组49.64±4.9950.50±8.1359.45±13.6861.77±12.33注：同列数据肩标A或a表示与细胞对照组相比，B或b表示与PRV组相比，小写字母表示差异显著（P0.05），大写表示差异极显著（P0.01），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。ng/L2.3.2两种有效成分对PRV感染3D4/2细胞IL-6分泌水平的影响（见表4）由表4可知，与细胞对照组相比，PRV感染3D4/2细胞12 h时IL-6分泌水平显著升高（P0.05），8 h和24 h时极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.018.T004表4两种有效成分对PRV感染3D4/2细胞IL-6分泌水平的影响组别8 h12 h24 h48 h细胞对照组1 485.19±57.841 598.56±163.801 148.01±57.481 035.14±46.64PRV组1 902.78±114.67A1 777.92±157.20a1 481.81±68.48A1 183.52±57.28aPRV+HYP10组1 869.26±61.991 882.31±112.101 586.99±79.991 387.08±101.32PRV+HYP20组1 431.67±63.61B1 475.97±138.701 149.31±59.76B1 219.17±45.35PRV+HYP40组1 819.91±80.111 753.84±101.181 267.22±74.63b1 295.14±39.93PRV+QUE10组1 700.93±75.042 104.86±171.871 379.58±55.521 505.42±52.53BPRV+QUE40组1 356.25±63.47B1 465.88±143.041 130.05±44.53B1 336.11±67.64PRV+QUE160组1 751.39±78.461 585.28±709.651 258.8±81.30b1 311.48±121.91PRV+芦丁组1 817.82±77.092 033.29±121.011 430.09±64.961 394.22±65.49bng/L与PRV组相比，PRV+HYP20组在处理8、24 h时3D4/2细胞IL-6的分泌水平极显著降低（P0.01），PRV+HYP40组在24 h时3D4/2细胞中IL-6的分泌水平显著降低（P0.05）；PRV+QUE40组在8、24 h时3D4/2细胞中的IL-6分泌水平极显著降低（P0.01）；PRV+QUE160组在24 h时3D4/2细胞中IL-6的分泌水平显著降低（P0.05）。2.3.3两种有效成分对 PRV 感染 3D4/2 细胞TNF-α分泌水平的影响（见表5）由表5可知，与细胞对照组相比，PRV感染3D4/2细胞在12、24、48 h细胞的TNF-α分泌水平显著升高（P0.05），8 h时TNF-α分泌水平极显著升高（P0.01）。与PRV组相比，PRV+HYP20组在8 h时3D4/2细胞中TNF-α水平极显著降低（P0.01），12 h时3D4/2细胞中TNF-α水平显著降低（P0.05）；PRV+QUE40组在8 h时3D4/2细胞中TNF-α分泌水平极显著降低（P0.01），处理24 h时3D4/2细胞中TNF-α水平显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.018.T005表5两种有效成分对PRV感染3D4/2细胞TNF-α分泌的影响组别8 h12 h24 h48 h细胞对照组561.25±53.28621.25±48.49516.14±22.21464.78±20.73PRV组743.21±8.17A704.81±36.26a590.86±37.75a560.39±15.48aPRV+HYP10组854.90±83.19892.27±79.82565.30±27.27576.67±20.46PRV+HYP20组569.81±58.30B545.29±24.18b465.98±31.96485.09±43.17PRV+HYP40组648.24±26.04741.32±49.30523.44±24.06545.39±15.87PRV+QUE10组772.44±134.10914.17±69.32B508.33±14.49608.89±21.67PRV+QUE40组571.06±55.10B570.51±27.69435.19±22.14b458.94±34.18PRV+QUE160组714.84±58.55750.32±42.22435.64±28.76b564.33±35.09PRV+芦丁组867.95±89.66b832.28±57.36655.48±104.40665.17±100.51ng/L3讨论3.1QUE和HYP对3D4/2细胞活性的影响在细胞上进行相关药物的安全剂量测定，对客观评判药物的毒副作用、确认临床最大的用药剂量具有一定的参考作用。只有先进行药物细胞水平的安全性试验，筛选出对细胞无毒性的安全浓度范围，才能够进一步对药物进行药理药效的研究。巨噬细胞为单核细胞转变形成的一种免疫细胞，能够发挥吞噬作用清除病原体，通过参与免疫反应和免疫调节及抑制过程组成机体天然免疫系统[12]。3D4/2细胞为人工培育的猪肺泡巨噬细胞（PAM）的稳定传代细胞系，具有巨噬细胞分泌细胞因子的功能[13]。猪感染PRV的主要病理变化及临床症状在呼吸系统，3D4/2细胞可被PRV感染。因此本试验选用肺泡巨噬细胞炎症模型为研究对象，通过对不同浓度的两种有效成分在不同的处理时间点对3D4/2细胞活性影响的研究中，进行CCK8试验及显微镜下观察，发现在超过160 μmol/L的槲皮苷及40 μmol/L金丝桃苷处理组中发现明显的细胞病变，且随浓度降低细胞病变减少。3.2QUE和HYP对PRV感染3D4/2细胞炎症因子分泌水平的影响黄酮类化合物具有潜在的抗单纯疱疹病毒活性。鱼腥草中提取的黄酮类化合物Houttuynoid A可以有效抵抗疱疹病毒的增殖，减轻HSV-1感染小鼠模型损伤[14]。黄酮类化合物对HSV-1诱导的小鼠脑炎具有治疗作用，杠板归提取物处理HSV-1小鼠，能够提高小鼠的存活率和存活时间[15]。多数天然黄酮是从植物中提取的多元酚混合物，以其主要活性成分在体内外发挥抗炎和抗氧化作用。黄酮类化合物可以通过减轻机体氧化应激和炎症反应降低疼痛。仙人掌总黄酮能够抑制大白鼠足跖肿胀炎症，虎杖提取物能够有效抑制小鼠耳部水肿和中性粒细胞浸润，反式白藜芦醇可以减轻炎症反应，玉米须总黄酮能够改善家兔急性痛风关节炎[16-18]。研究发现，QUE及HYP对机体组织细胞具有一定的保护作用[19-20]。辣蓼在许多炎症的治疗中也有出色的疗效，如慢性鼻炎[21]、外用于神经性皮炎[22]、急性肠炎[23]、病毒导致的角膜炎、急性或慢性结膜炎等。因此，辣蓼有效成分抗PRV感染引起的炎症的研究具有一定的现实意义。细胞因子是一种分子量小于40 kDa的分泌蛋白，能够调节和影响免疫应答。促炎细胞因子的释放将激活免疫系统，进一步释放细胞因子上调炎症过程[24]。适量的促炎因子能够调节机体内环境平稳，提高免疫能力，但过量的促炎细胞因子会增加炎症发展的进程，抑制机体免疫系统[25]。抗炎因子属于能够抑制促炎因子和削弱炎症刺激的多效免疫调节因子，能够调节持续的炎症反应[26]。因此，炎症细胞因子的实际浓度过高或者过低均会影响机体内部的动态平衡，并且会削弱和扰乱宿主对病原体的清除效果。IL-6是B细胞刺激因子，具有双面调节特性，是癌症、感染或自身免疫性疾病炎症水平的指标。IL-1β与髓样分化因子（myeloiddifferentiationfactor 88，MyD88）的合成和启动炎症信号通路有关，病变部位聚集的大量炎性细胞刺激炎症介质的产生，进而引发全身炎症反应。TNF-α是一种促炎细胞因子，能够抑制肿瘤细胞的增殖、参与炎症反应和免疫反应，在细菌、病毒等刺激单核巨噬细胞时大量产生。TNF-α在低浓度时可增加炎症局部的白细胞数量，引起大量细胞因子生成，诱导炎症反应；当TNF-α浓度增高时则可进入血液，刺激促炎因子如IL-2、IL-6的进一步分泌，加重炎症反应甚至引起体温升高[27]。PRV感染3D4/2细胞能够显著增加细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平。本试验中，与感染不处理组比较，40 μmol/L的QUE和20 μmol/L的HYP可以显著或极显著下调感染细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平。因此，一定浓度的QUE和HYP对3D4/2细胞活性有促进作用，且对PRV感染3D4/2细胞引发的炎症反应具有一定的干预作用，对炎症产生的炎症介质的分泌具有抑制作用。4结论本试验通过CCK-8法和CPE确定了QUE对3D4/2细胞的最大安全浓度为160 μmol/L；HYP对3D4/2细胞的最大安全浓度为40 μmol/L。QUE与HYP处理均能够降低PRV感染3D4/2细胞引起的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌水平的增高，从而抑制由PRV感染3D4/2诱导的细胞炎性反应。