我国柑橘资源丰富，柑橘产量较高[1]。柑橘渣是柑橘加工后的副产品，包含果浆、果皮、果核等，每加工100 t柑橘类水果产生约40~60 t的副产品[2]，直接丢弃这些副产品会严重污染环境，危害人们的生活和健康，而低效的处理方法会产生高昂的成本[3-5]。因此，需要寻找适合柑橘副产品的处理方法。柑橘渣中不仅富含功能性成分，而且含有丰富的碳水化合物、蛋白质和脂肪等营养成分，对动物生长和健康有很高的价值，具有较大的饲料开发潜力[6-9]。但柑橘渣存在水分高、蛋白含量低、纤维含量高、适口性差等问题，直接饲喂动物的营养价值不高[10]。固态发酵技术具有成本相对较低、耗能低、产量高、稳定性好、生长迅速等优点[11-12]。固态发酵处理农产品加工废弃物可产生具有额外营养或促进健康的成分，微生物发酵可促进功能物质从基质释放，或将废弃物中的化合物进行生物转化[13]。因此，应用微生物发酵技术生产发酵饲料的耗能低，而且发酵果渣中含有大量酚类、类黄酮、有机酸等抗菌、抗氧化、抗炎活性物质以及益生菌，有助于提高机体免疫力，改善肠道微生态环境[14]，提高发酵饲料的营养价值和适口性。微生物发酵技术生产发酵饲料还能够缓我国蛋白饲料资源缺乏的问题，从而推进饲料行业的可持续发展。本研究以柑橘渣为原料，加入辅料麸皮，采用不同菌种对柑橘渣进行固体发酵，对发酵基质比例、菌液接种量和发酵时间进行正交分析，以发酵产物中的粗蛋白质含量为考核指标，确定最优发酵工艺条件，为高效利用柑橘渣发酵生产蛋白饲料提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1原料柑橘渣由重庆天邦食品有限公司提供，麸皮为市售。1.1.2菌种热带假丝酵母（Candida tropicalis CBS 2311）和葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae B157B）；黑曲霉（Aspergillus niger APBSDSF57）、康宁木霉（Trichoderma koningii isolate CTCCSJ-G-HB40448）、桔青霉（Penicillium citrinum isolate PL4）和小孢根霉（Rhizopus microsporus isolate ATH64），以上菌种均由广东省农业科学院蚕业与农产品加工所果蔬深加工研究室提供。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum CGMCC1258）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），均由本研究室提供。1.1.3培养基制备MEB培养基：使用时称取15 g，加入1 L蒸馏水混匀，121 ℃高压灭菌15 min，培养酵母菌使用。PDA培养基：使用时称取24 g，加入1 L蒸馏水混匀，121 ℃高压灭菌20 min，培养霉菌使用。MRS培养基：使用时称取54 g，加入1 L蒸馏水混匀，121 ℃高压灭菌15 min，培养乳酸菌使用。LB培养基：使用时称取21 g，加入1 L蒸馏水混匀，121 ℃高压灭菌15 min，预培养细菌使用。上述培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。固体发酵培养基：发酵基质柑橘渣80%，辅料麸皮20%，含水率60%，1.5%尿素，自然pH值。1.2测定指标及方法1.2.1发酵工艺流程斜面菌种→活化→摇床培养→10%接种量接入固体发酵培养基→30 ℃发酵3 d→105 °C烘干→粉碎→成分测定。1.2.2单菌种发酵试验按1.1.3中配方制备培养基，以接种量10%接入单一酵母菌、霉菌、乳酸菌和芽孢杆菌的扩大培养液，30 ℃培养3 d，预筛出粗蛋白质含量较高的酵母菌和霉菌。对照组为不添加任何菌种的未发酵柑橘渣。1.2.3混合菌种发酵试验将1.2.2单菌种发酵试验中筛选的酵母菌和霉菌与乳酸菌和芽孢杆菌4菌种组合发酵，按1∶1∶1∶1比例接种，在30 ℃、含水率60%、尿素添加量1.5%条件下，以柑橘渣发酵基质比例（柑橘渣与麸皮比）（A）、接种量（B）和发酵时间（C）为考察因素[15-20]，设计3因素3水平正交试验，正交试验因素水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.014.T001表1L9（33）正交试验因素水平水平AB/%C/d19∶110428∶215637∶32081.2.4营养成分干物质、粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、钙和总磷分别采用干燥法、凯氏定氮法、酸碱消煮法、索氏抽提法、灼烧法、乙二胺四乙酸二钠络合滴定法和分光光度法测定，均参照《饲料分析与检测》[21]测定。1.3数据统计与分析采用DPS 7.05软件对试验数据进行正交分析，采用SPSS 26.0软件对正交分析试验结果进行方差分析。2结果与分析2.1不同菌种发酵对柑橘渣粗蛋白和粗纤维含量的影响（见表2）单一菌种发酵试验共进行两组，其中霉菌4株，酵母菌2株，发酵后烘干粉碎，测定柑橘渣中粗蛋白质和粗纤维含量。而乳酸菌和芽孢杆菌各只有1株，故不做预筛选，直接进入多菌种混合发酵环节。由表2可知，与对照组相比，不同菌种发酵均可不同程度地提高粗蛋白质含量，降低粗纤维含量；霉菌中的黑曲霉产生的粗蛋白质含量最高，粗纤维含量最低，粗蛋白质含量比对照组提高了43.37%，粗纤维含量比对照组降低了25.61%；酵母菌中热带假丝酵母产生的粗蛋白含量最高，粗纤维含量最低，粗蛋白质含量比对照组提高了45.61%，粗纤维含量比对照组降低了15.51%。因此，在后续混合发酵试验选用黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌进行试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.014.T002表2不同菌种发酵对柑橘渣粗蛋白和粗纤维含量的影响菌种粗蛋白（CP）粗纤维（CF）对照组10.2620.38霉菌黑曲霉14.7115.16桔青霉14.6515.42康宁木霉14.0315.96小孢根霉14.6315.56酵母菌葡萄牙棒孢酵母14.6717.79热带假丝酵母14.9417.22植物乳杆菌14.8616.17枯草芽孢杆菌14.8815.97%2.2混合菌种发酵工艺的优化按表2结果筛选出发酵产品粗蛋白质含量较高的黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌按1∶1∶1∶1体积比混匀，在30 °C、含水量60%、尿素添加量1.5%，选择发酵基质比例、接种量和发酵时间进行3因素3水平正交试验，进行3次重复试验。正交试验极差、方差分析见表3、表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.014.T003表3L9（33）正交试验极差分析项目ABCCP/%123总计均值111115.4216.5216.5948.5316.18212216.0015.8116.3248.1316.04313316.6316.4816.6949.8016.60421217.4917.3717.2952.1517.38522317.9817.6218.0653.6617.89623117.8117.7217.7353.2617.75731318.9818.1618.6355.7718.59832119.1018.9518.1056.1518.72933218.7318.2718.5955.5918.53k116.2717.3817.55k216.6717.5517.32k318.6117.6317.69R2.340.240.3710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.014.T004表4正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值A24.938 8212.469 4114.188 60.000 1B0.280 220.140 11.283 00.337 5C0.638 520.319 22.923 10.099 5误差2.184 0200.109 2注：P0.05表示影响显著，P0.05表示影响不显著。由表3可知，各因素对粗蛋白质的含量的影响排序为ACB。由k值可知，A3B3C3组合粗蛋白质含量最高，即基质比例7∶3、接种量20%、发酵时间8 d的结果最优。由表4可知，，因素A对粗蛋白含量具有极显著影响（P0.01），因素B和因素C对粗蛋白含量影响不显著（P0.05）。2.3柑橘渣发酵最佳工艺条件营养成分（见表5）由表5可知，柑橘渣发酵粗蛋白质含量由发酵前的11.67%增长至18.72%，提高了60.41%；粗纤维含量从12.83%降低至10.28%，降低了19.88%；粗脂肪含量由2.27%增长至2.46%，提高了8.37%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.014.T005表5柑橘渣发酵最佳工艺条件营养成分项目干柑橘渣（柑橘渣与麸皮）发酵柑橘渣水分9.6153.59粗蛋白11.6718.72粗脂肪2.272.46粗纤维12.8310.28灰分4.594.55无氮浸出物60.4410.41中性洗涤纤维28.9628.87酸性洗涤纤维13.5015.34钙1.261.49总磷0.100.14%3讨论3.1不同菌种发酵对柑橘渣的营养成分的影响柑橘渣蛋白质含量低，纤维含量高，适口性差。因此，增加柑橘渣中粗蛋白质含量、降低粗纤维含量是提高柑橘渣品质的方式之一。本试验表明，黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌利用柑橘渣的能力更好，表现为柑橘渣发酵粗蛋白质含量相对较高；多菌发酵试验表明，组合菌株均比单一菌株发酵后产生的粗蛋白含量高，粗纤维含量低。可能是因为混合菌种在发酵的过程中产生协同和相互作用。黑曲霉可产生糖化酶、植酸酶、纤维素酶等多种酶系，还能产酸，降低饲料pH值，对酵母菌的生长有积极作用；热带假丝酵母产生的酵母蛋白较高，这对提高饲料中粗蛋白的含量有益；枯草芽孢杆菌和黑曲霉作用类似，与黑曲霉具有协同发酵作用；植物乳杆菌可通过产生乳酸，降低饲料pH值，提高饲料适口性[22]。因此，将单菌发酵筛选出的黑曲霉、热带假丝酵母、植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌混合发酵柑橘渣，可以改善饲料适口性，减少粗纤维含量，而且还可通过相互作用之间所产生的营养物质合成菌体蛋白，增加粗蛋白质含量。3.2混合菌种发酵工艺的优化本试验中，发酵过程中的基质比例、接种量、时间等因素交互作用对发酵均有显著影响，各因素对粗蛋白含量的影响排序为ACB。固体发酵试验中需要为微生物的生长提供适量的营养物质，选择麸皮作为发酵辅料，麸皮可以作为碳源和氮源，也能提供维生素和矿物元素，其多孔结构可以提供需氧环境[23]。若麸皮比例过大，会影响柑橘渣间的密度，影响氧气的传递，不利于发酵[24]。若发酵时间太短，产生的粗蛋白质不足，而发酵时间过长会增加生产成本，易产生杂菌，影响发酵产物品质[19]。接种量对发酵周期和菌株产酶均具有较大影响。适宜接种量可让产物合成提前，但过多会导致菌体生长过快、过稠，造成营养物质损失并产生过多的代谢废物，较少接种量会导致菌体繁殖缓慢，从而延长发酵周期[25]。通过分析正交试验结果可知，发酵基质比例对粗蛋白质含量存在极显著影响，原因可能是在适宜基质比例下，麸皮比例越大，给菌体提供的氮源越多，越能够充分发挥菌体生产蛋白的能力，进而增加发酵产物中粗蛋白质含量；而发酵时间和接种量的不同水平之间无显著差异，可能是发酵空间相对较小，导致发酵产物中粗蛋白含量较少。4结论通过本试验的优化，确定了利用柑橘渣发酵生产蛋白饲料的工艺条件。在含水量为60%，发酵温度为30 ℃，Aspergillus niger、Candida tropicalis、Lactobacillus plantarum和Bacillus subtilis接种比例为1∶1∶1∶1，尿素添加量为1.5%条件下，柑橘渣发酵最适工艺条件为，基质柑橘渣与麸皮比例7∶3，接种量20%，发酵时间8 d，发酵后的粗蛋白含量为18.72%，比发酵前提高了60.41%。