豆粕是我国饲料生产中应用最广泛的蛋白饲料原料，豆粕原料价格上升导致畜禽养殖经济效益受到影响[1]。因此，需要开发新的蛋白饲料原料降低饲料生产成本，提高养殖经济效益[2]。饲用植物副产物二次开发与利用是解决该问题的有效途径[3]。我国具有丰富的马铃薯资源[4]，食品行业每年会产生大量马铃薯渣[5]，合理开发与利用马铃薯渣对减轻环境压力、降低养殖成本具有重要意义[6]。研究表明，马铃薯渣中富含多种维生素[7]、多肽[8]及多糖等动物生长必需的营养物质[9]，但马铃薯渣中含有龙葵素和糖苷碱等物质会影响饲料的适口性，不适合在饲料生产中应用。微生物发酵是马铃薯渣的饲料化利用的主要方式[10]。本研究以马铃薯渣为主要原料，通过固态发酵生产蛋白饲料，以蛋白质含量为目标对发酵工艺参数进行优化，为提高马铃薯渣的饲用价值、降低饲料生产成本、减轻马铃薯渣引起的环境污染提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验原料及菌种试验主要原料为淀粉生产后所剩的马铃薯渣和麸皮，由湖南湘泉集团淀粉有限公司提供。试验原料烘干，粉碎，过40目筛，将粉碎物置于115 ℃高压灭菌锅20 min，烘干。主要辅料为硝酸铵、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁由本院实验室提供。微生物：苏云金杆菌由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供（CGMCC平台资源编号1511C0002100000767）、枯草芽孢杆菌（CGMCC平台资源编号1511C0002100009606）、汉逊酵母（CGMCC平台资源编号1511C0002200005174）、多孢木霉（保藏编号CPCC 40003）由中国药学微生物菌种保藏管理中心提供。1.1.2试验培养基及种子液苏云金杆菌在沙氏琼脂培养基中培养，培养基组成为：10.0 g牛肉膏蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化钠、1 L蒸馏水。种子液制备：在沙氏琼脂培养基中接种苏云金杆菌，30 ℃恒温箱中培养24 h。二级种子培养基制备：在沙氏琼脂培养基中接种1%种子液，30 ℃恒温箱中培养30 h。枯草芽孢杆菌在沙堡弱培养基中培养，培养基组成为：40.0 g葡萄糖、10.0 g蛋白胨、12.0 g琼脂、1 L蒸馏水。种子液制备：在沙堡弱培养基中接种枯草芽孢杆菌，20 ℃恒温箱中培养24 h。二级种子培养基制备：在沙堡弱培养基中接种种子液，接种量为1%，20 ℃、220 r/min振荡培养24 h。汉逊酵母在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中培养，培养基组成为：10.0 g酵母粉、20.0 g蛋白胨、20.0 g葡萄糖、1 L蒸馏水。种子液制备：在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中接种汉逊酵母，30 ℃以220 r/min振荡培养24 h。二级培养基制备：在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中接种1%种子液，30 ℃、220 r/min振荡培养24 h。多孢木霉培养基在察氏培养基中培养，培养基组成为：3.0 g硝酸钠、1.0 g磷酸二氢钾、0.5 g硫酸镁、0.5 g氯化钾、0.01 g硫酸亚铁、30.0 g葡萄糖、15.0 g琼脂、1 L蒸馏水。种子液制备：在察氏培养基中接种多孢木霉，28 ℃、220 r/min振荡培养36 h。二级培养基制备：在察氏培养基中接种1%种子液，28 ℃、220 r/min振荡培养36 h。按照微生物数量等量混合原则将培养基混合，使枯草芽孢杆菌、汉逊酵母、苏云金杆菌及多孢木霉在混合培养基中数量均约为0.5×108 CFU/g，用于后续发酵试验。1.2试验仪器V-5000型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、HWS型恒温恒湿培养箱（上海丙林电子科技有限公司）、HD-E804-A电热恒温鼓风干燥箱（海达国际仪器有限公司）、EX-E型电子天平（厦门金测电子科技有限公司）、JBCJ-FC型双人净化工作台（苏州佳宝净化工程设备有限公司）、SHZ-B型双层恒温摇床（上海赫田科学仪器有限公司）、HH-420型数显恒温水浴锅（上海比朗仪器制造有限公司）、培养皿、GK-600凯氏定氮仪（山东格林凯瑞精密仪器有限公司）、SX-300高压灭菌锅（日本TOMY）。1.3测定指标及方法1.3.1马铃薯渣培养基组成（见表1）将马铃薯渣、麸皮等原料高压灭菌，混匀以制成马铃薯渣培养基。将马铃薯渣培养基置于灭菌锅中再次灭菌，灭菌方式同上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.T001表1马铃薯渣培养基组成组成马铃薯渣麸皮磷酸二氢钾硝酸铵硫酸镁尿素比例84.8812.000.600.500.022.00%1.3.2蛋白质测定由于发酵过程中使用尿素、硝酸铵等物质，为提高蛋白质检测的准确性，研究测定的蛋白质为真蛋白质，按照《饲料中蛋白质的测定》（DB13/T 1098—2009）方法进行测定，蛋白质含量以质量分数形式表示，单位为%。1.3.3初始生产工艺设定参考文献[11]将马铃薯渣、麸皮、磷酸二氢钾等按照比例混合制成培养基为最佳培养基，且微生物以苏云金杆菌、枯草芽孢杆菌、汉逊酵母、多孢木霉按照等量混合接种发酵。本试验在此基础上，对发酵时间、发酵温度、微生物接种量进行考察，设置初始发酵工艺参数为：发酵时间36 h、发酵温度30 ℃、微生物接种量1.5%。1.3.4单因素试验固定发酵温度30 ℃、微生物接种量1.5%，考察发酵时间在24、36、48、60、72、84、96 h时发酵产物中真蛋白质含量，根据真蛋白质含量获得最佳发酵时间。固定发酵时间36 h、微生物接种量1.5%，考察发酵温度在29、30、31、32、33、33、35 ℃时发酵产物中真蛋白质含量。固定发酵时间36 h、发酵温度30 ℃，考察微生物接种量为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%时发酵产物中真蛋白质含量。1.4响应面试验设计根据单因素试验结果，以发酵时间（A）、发酵温度（B）、微生物接种量为变量（C），以真蛋白质含量为优化目标，使用Box-Behnken响应面法对参数进行优化。响应面因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.T002表2响应面因素水平设计水平A/hB/℃C/%-160322.5072333.5184344.51.5数据统计与分析采用Excel软件对数据进行初步整理，Design Expert软件进行优化和方差分析，所有试验重复数为3次。结果以平均值表示。2结果与分析2.1马铃薯渣中蛋白质含量（见表3）为了更直观地展示混菌固态发酵的效果，发酵试验开始前，对马铃薯渣中蛋白质含量进行测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.T003表3马铃薯渣中蛋白质含量项目123456平均值CV含量3.863.843.873.813.853.923.860.95%2.2单因素试验结果2.2.1发酵时间对发酵物蛋白质含量的影响（见图1）由图1可知，随发酵时间延长，发酵物中蛋白质含量逐渐上升，但当发酵时间达到84 h时，蛋白质含量逐渐呈下降趋势。因此，选择发酵时间为60~84 h进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.F001图1发酵时间对发酵物中蛋白质含量的影响2.2.2发酵温度对发酵物蛋白质含量的影响（见图2）由图2可知，29~33 ℃发酵物中蛋白质含量随温度升高而提高，达到34 ℃时，蛋白质含量迅速下降。因此，选择温度为32~34 ℃用于后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.F002图2发酵温度对发酵物中蛋白质含量的影响2.2.3微生物接种量对发酵物蛋白质含量的影响（见图3）由图3可知，微生物接种量的提高可以提升发酵物中蛋白质含量，但接种量达到4.5%后，蛋白质含量出现小幅度下降并趋于稳定。因此，选择微生物接种量2.5%~4.5%用于后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.F003图3微生物接种量对发酵物中蛋白质含量的影响2.3响应面试验结果及分析2.3.1响应面试验结果（见表4）根据单因素试验结果设计响应面试验方案，并根据对应参数进行发酵试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.T004表4响应面试验结果编号A/hB/℃C/%蛋白质含量/%160323.519.57284323.523.59360343.514.72484343.517.94560332.520.08684332.521.93760334.515.76884334.520.32972322.521.441072342.515.841172324.520.811272344.515.911372333.524.181472333.522.941572333.523.561672333.523.251772333.523.562.3.2建模与显著性分析利用Design Expert软件对响应面试验结果进行显著分析。方差分析结果见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.T005表5方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性回归模型159.540 0917.730 027.350.000 1**A23.290 0123.290 035.940.000 5**B55.120 0155.120 085.060.000 1**C5.270 015.270 08.120.024 7*AB0.160 010.160 00.250.634 5AC1.840 011.840 02.830.136 2BC0.122 510.122 50.190.676 8A213.050 0113.050 020.130.002 8**B232.610 0132.610 050.310.000 2**C220.660 0120.660 031.880.000 8**残差4.540 070.648 1失拟项3.690 031.230 05.820.061 0纯误差0.845 740.211 4总离差164.080 016注：1.R2=0.972 4，R2adj=0.936 8，CV=3.96%。2.“*”表示影响显著（P0.05）；“**”表示影响极显著（P0.01）。由表5可知，一次项中，A、B对蛋白质含量的影响极显著（P0.01），C对蛋白质含量影响显著（P0.05）；所有因素二次项对蛋白质含量的影响均极显著（P0.01）；交互项对蛋白质含量的影响均未达到显著水平（P0.05）。失拟项未达到显著水平，决定系数R2=0.972 4，校正决定系数R2adj=0.936 8，CV为3.96%，表明本研究所使用的拟合模型可以真实反映发酵物蛋白质含量与3种因素的关系。根据方差分析结果可知各项因素对蛋白质含量的影响为：BAC。经过多次拟合，得到蛋白质含量与发酵时间、发酵温度、微生物接种量二次多项回归方程为：蛋白质含量（Y）=-1.76A2-2.78B2-2.22C2-0.2AB+0.677 5AC+0.175BC+1.71A-2.62B-0.811 3C+23.50。2.3.3响应面图和等高线图分析各因素间互作的响应面与等高线图见图4。由图4可知，AB、AC、BC交互项等高线呈接近圆形，表明各交互项对蛋白质含量影响并不显著，与方差分析结果一致。图4各因素间互作的响应面与等高线图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.F4a1（a）发酵时间与发酵温度对蛋白质含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.F4a2（b）发酵时间与接种量对蛋白质含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.F4a3（c）发酵温度与接种量对蛋白质含量的影响2.4最佳工艺参数的确定根据实际试验数据所得回归模型，Design Expert软件自动生成的最佳参数工艺为：发酵时间79.885 2 h，发酵温度32.609 4 ℃，微生物接种量3.302 86%，在此条件下蛋白质含量的预测值为24.510 8%。本研究结合实际生产情况，将工艺参数调整为发酵时间79.9 h、发酵温度33.6 ℃、微生物接种量3.3%，重复发酵6次，调整后马铃薯渣发酵蛋白质量含量平均为23.74%。尽管在调整后的工艺参数下，实际发酵产物中蛋白质含量低于最佳理论值24.510 8%，但更符合实际生产需求，能够保持较高的发酵效率，发酵马铃薯渣中蛋白质含量见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.022.T006表6发酵马铃薯渣中蛋白质含量项目123456平均值CV含量23.5623.8724.3923.4123.5323.6723.741.49%3讨论固态发酵是指以惰性底物为固体支持物，在整个过程中自由水含量极低的条件下进行微生物发酵[12-13]。固态发酵具有微生物生长快、酶活高、成本低、能耗低、操作便捷等优点[14-16]。微生物的选择与底物的组成是固态发酵的关键，目前在马铃薯固态发酵方面，研究微生物与底物选择的试验较多[17-19]。因此，本研究并未将研究重点置于这2种因素，而将研究重点放在与规模生产关联紧密的发酵时间、发酵温度及微生物接种量3种因素。不同研究关于马铃薯渣混菌固态发酵的效果不同[20]。程方[21]研究发现，通过黑曲霉Z9和啤酒酵母PJ等量混合加入马铃薯渣培养基中发酵，蛋白含量可高达41.72%。而赵颜[11]研究表明，马铃薯渣发酵物中蛋白质含量接近25%。研究均认为以马铃薯渣为原料通过混菌固态发酵可以高效生产蛋白饲料。4结论马铃薯渣作为原料，利用混合微生物固态发酵可生产优质的蛋白饲料。根据单因素试验和响应面试验优化结果，结合实际生产需要，认为马铃薯渣混菌固态发酵最佳工艺参数为发酵时间79.9 h、发酵温度33.6 ℃、微生物接种量3.3%，在此条件下可以生产蛋白质含量为23.74%的蛋白饲料原料。