甘蔗渣纤维素含量约为50%，半纤维素含量约为30%，是来源丰富、价格低廉的生物质原料[1-2]。蔗渣含有丰富的多糖类物质，木质素分子质量和聚合度低，合理开发利用蔗渣能够产生较好的经济效益和社会效益[3-4]。蔗渣纤维素预处理的方法基本均需要添加酸碱或其他试剂，进行高温加热，具有能耗高、费时长、后处理难的缺点。纤维素酶是参与水解植物细胞壁纤维素的酶，纤维二糖水解酶（EC 3.2.1.91）、内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）和葡聚糖内切酶（EC 3.2.1.21）通过协同作用降解纤维素，纤维素酶系的协同作用可以将纤维多糖降解为葡萄糖[5-6]，在食品、饲料、轻工业、能源等方面应用广泛[1-4,7-8]。纤维素酶在饲料、纺织、食品和洗涤等行业具有较大的应用潜力。添加纤维素酶的藜麦麸皮可以明显提高台湾红藜青贮饲料的饲用价值；添加纤维素酶、木聚糖酶可以提高象草青贮发酵品质与体外消化率，组合添加酶效果好；添加纤维素酶可以有效提升砂仁叶的青贮品质[9-12]。本课题组前期研究表明，厚垣镰孢霉HML278是可产完整耐热纤维素酶系及半纤维素酶的新菌种[13]。厚垣镰孢霉HML278所产的两种β-葡萄糖苷酶均具有转苷活性[14]，有利于乙醇合成。本课题组筛选的β-葡萄糖苷酶菌种米曲霉HML366，所产的138 kDa β-葡萄糖苷酶具有转苷活性，可以利用葡萄糖合成龙胆二糖[15]。龙胆二糖可以诱导微生物产纤维素酶，混合培养可提高产酶量[16]。镰孢属的菌种可以产纤维素酶和酒化酶，直接水解糖化纤维素后发酵产乙醇，尖廉孢霉（Fusarium lini）能够促进葡萄糖转化乙醇和醋酸[17]，Fusarium spp.促进木糖和葡萄糖转化乙醇[18]。关于尖廉孢霉（F. oxysporum）的研究较多，F. oxysporum F3能够促进纤维素转化乙醇[19]。尖廉孢霉（F. oxysporum）的β-葡萄糖苷酶具有转苷活性，通过转苷作用催化多种二糖得到β-D-葡萄糖，尖廉孢霉可以直接水解纤维素糖化后再合成乙醇、乙二醇、丙三醇，由于β-葡萄糖苷酶具有转苷活性，优先合成一元醇[20]。米曲霉HML366所产的高酶活木聚糖酶可以水解木聚糖，使纤维素结构变松散，有利于纤维素酶水解纤维素[21]。本试验以甘蔗渣为原料，简化蔗渣纤维素预处理工艺，将米曲霉HML366和厚垣镰孢霉HML278混合培养，优化纤维素酶系组成提高产酶量，为蔗渣纤维素的综合利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种米曲霉HML366和厚垣镰孢霉HML278菌种，PDA斜面4 ℃保存于河池学院微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室。1.1.2甘蔗蔗渣甘蔗蔗渣由广西博庆食品有限公司提供，粉碎至50目（筛孔尺寸为0.300 mm）和100目（筛孔尺寸为0.150 mm）。1.1.3试验试剂3,5-二硝基水杨酸为分析纯购自上海如吉生物科技发展有限公司；四水合酒石酸钾钠、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠，均购自国药集团化学试剂有限公司；酒石酸钾钠、刚果红，均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；二水柠檬酸三钠、苯酚，均购自汕头市西陇化工股份有限公司；水杨苷购自上海晶纯试剂有限公司。1.2试验仪器Microfuge 20R高速冷冻离心机购自美国贝克曼库尔特有限公司；ZXSD-A1160生化培养箱购自上海智城分析仪器制造有限公司；SW-CJ-IF超净工作台购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司。ZWY-2102双层恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司；HVE-50高压灭菌锅购自日本Hirayama公司；HH-6型数显恒温水浴锅购自国华电器有限公司；Tecan Infinite M200Pro全波长酶标仪购自TECAN公司；JM-B5107电子天平购自余姚市纪铭称重校验设备有限公司；Reseaarch olus单道可调移液器购自德国艾本德股份有限公司；G100M25MSL-W1格兰仕微波炉购自广东格兰仕微波生活电器制造公司。1.3测定指标及方法1.3.1固体发酵产纤维素酶纯化的斜面菌种配成107个孢子浓度的悬液，取2 mL加入固体发酵培养基，参考文献[9]固体发酵产纤维素酶。1.3.2酶活测定参照文献[22]测定滤纸酶活、葡聚糖内切酶活；参考Ghose[23]方法测定微晶纤维素酶活；参照文献[24]测定β-葡萄糖苷酶酶活；参照Bailey等[25]方法测定木聚糖酶活。1.3.3微波+磷酸+蒸汽爆破预处理蔗渣纤维素称取10 g洗净风干的蔗渣，加入盛有90 mL l% H3PO4的500 mL的烧杯中，放入微波炉中高火处理20 min，滤干，使用自来水清洗数次直至pH值呈中性，70 ℃干燥至恒重。取微波+磷酸处理洗净风干的蔗渣10 g，加入盛有90 mL ddH2O的500 mL烧杯中，高压蒸汽灭菌锅中121 ℃、0.145 Mpa处理0.5 h，70 ℃干燥至恒重。取未处理蔗渣，标记为A；取步骤1处理蔗渣，标记为B；取步骤2处理蔗渣，标记为C，参照1.3.1以厚垣镰孢霉HML278为菌种，固体发酵产纤维素酶。分别取1 g上述A、B、C三类蔗渣样品放入试管中，加入2 mL 0.02 mol/L，pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液（HAC-NaAC），添加培养4 d的0.5 mL厚垣镰孢霉HML278纤维素酶液，50 ℃水浴中保温60 min取出，沸水浴5 min冷水浴灭酶活，参照1.3.2 DNS法测定葡萄糖和木糖含量。1.3.4蔗渣酶解还原糖分析各取1 g蔗渣加入2 mL 0.02 mmol/L、pH值4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液（HAC-NaAC），添加培养4 d的0.5 mL厚垣镰孢霉HML278纤维素酶液，50 ℃水浴中保温60 min取出，沸水浴5 min使纤维素酶变性，冷却至室温，4 000 r/min离心10 min取上清液，参照1.3.2 DNS法测定葡萄糖和木糖含量，分别做3个平行试验。1.3.5厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵产酶取1.3.3处理后的蔗渣，参照1.3.1固体发酵产纤维素酶，先接种107个厚垣镰孢霉HML278孢子，30 ℃培养，不同培养瓶分别在24、36、48 h接种107个米曲霉HML366孢子，48 h后每培养瓶补充0.14 g (NH4)2SO4，厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366在同样条件单独接种对照培养，分别做3个平行试验。第4 d开始每天取样，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，取上清粗酶液测定滤纸酶活和β-葡萄糖苷酶活，测定3个平行样品取平均值。2结果与分析2.1预处理蔗渣纤维素的产酶结果使用粉碎颗粒小的100目材料培养，微生物可以接触更多的纤维素底物，诱导产更多的纤维素酶。预处理蔗渣纤维素的产酶结果见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.016.T001表1预处理蔗渣纤维素的产酶结果目数酶种类原始蔗渣（A）微波+磷酸（B）微波+磷酸+气爆（C）50目FPase3.25.18.8CMCase4.17.624.6β-glucosidase16.736.947.6xylanase76.4148.6257.2100目FPase14.321.928.9CMCase16.824.542.9β-glucosidase46.658.872.8xylanase140.2227.4338.6U/mL由表1可知，100目原始蔗渣的滤纸酶活（FPase）比50目材料的提高347%，达到14.3 U/mL；100目原始蔗渣的木聚糖酶（xylanase）酶活为140.2 U/mL，比50目提高了83.50%。微波结合1%稀磷酸处理的100目蔗渣材料，FPase酶活达到21.9 U/mL，比原始蔗渣提高了53.15%；木聚糖酶酶活227.4 U/mL，比原始蔗渣提高了62.20%。增加气爆处理，高压蒸煮打破纤维素分子的结晶结构和保护层，使材料变得蓬松，易于被纤维素酶作用，酶活进一步提高，FPase酶活达到28.9 U/mL，比原始蔗渣提高了102%，比微波结合稀磷酸处理的材料提高了31.96%；xylanase酶活为338.6 U/mL，比原始蔗渣提高了142%，内切酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）的酶活均有提高。微波是电磁波，介电加热的频率一般是2.45 GHz，波长为12.7 cm，在电磁光谱中处于红外和无线电波之间的区域[26]。熊犍等[27]研究表明，微波处理样的分子间氢键、分子内氢键发生了变化，纤维素的分子间氢键在微波辐射处理过程中发生了变化。张丽等[28]对微波处理后棉纤维采用核磁共振碳谱分析其结晶结构的变化，结果发现，微波处理后棉纤维的结晶度下降，结晶的完整性被破坏，晶粒变小。微波技术应用于木质纤维素的预处理，改变木质纤维原料分子结构，提高糖化率[27-29]。蒸汽爆破破坏木质纤维素结构，逐步渗透至木质纤维素内部，实现木质素、纤维素和半纤维素的分离，部分果胶质和半纤维素等物质也在高温高压蒸汽作用下发生化学反应而转化为其他小分子物质，纤维素、半纤维素的糖化水解率提高[30-33]。本试验选用低浓度磷酸预处理蔗渣，纤维素酶系和木聚糖酶在偏酸环境下性质稳定。通过低浓度磷酸、微波和高压灭菌锅处理蔗渣，能够降低成本，保护环境。2.2蔗渣酶解还原糖分析厚垣镰孢霉HML278酶水解蔗渣糖化液主要成分见表2。由表2可知，经厚垣镰孢霉HML278固体发酵酶作用于微波、磷酸结合汽爆处理的100目蔗渣，得到还原糖主要包括葡萄糖和木糖，可以获取3.6 g/L葡萄糖，比原始蔗渣提高100％；可以获取3.9 g/L木糖，比原始蔗渣提高56.0％。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.016.T002表2厚垣镰孢霉HML278酶水解蔗渣糖化液主要成分目数成分ABC50目葡萄糖1.11.62.6木糖1.62.42.9100目葡萄糖1.82.23.6木糖2.53.03.9g/L甘蔗渣中纤维素含量达45%~50%，半纤维素含量为22%~30%，纤维素含量比半纤维素高[34]。获取木糖比葡萄糖多，推测是蔗渣经过处理后，对半纤维素类木聚糖解离度更大，酶解获取更多木糖。2.3厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵产酶结果纤维素酶中三种主要的酶组分葡聚糖外切酶、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶木聚糖酶均属于水解酶，水解酶类大都属于滞后合成型，酶在细胞生长一段时间或进入平衡期以后才开始生物合成并大量积累。厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵产酶时间见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.016.T003表3厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵产酶时间项目第4 d第5 d第6 d第7 d第8 dFPaseβ-GFPaseβ-GFPaseβ-GFPaseβ-GFPaseβ-G混合菌种24.673.230.498.642.6128.634.492.225.276.2厚垣镰孢霉HML27814.326.618.636.223.244.816.835.413.624.4米曲霉HML3664.240.26.258.47.666.65.652.44.442.2U/mL由表3可知，厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵酶液FPase和β-葡萄糖苷酶（β-G）酶活均强于单独发酵培养的菌种所产的酶液。米曲霉HML366在该培养条件下，可以产高转苷活性的β-G，合成龙胆二糖。龙胆二糖是强烈的产纤维素酶诱导物，可以诱导厚垣镰孢霉HML278产纤维素酶；高活性β-G可以分解纤维二糖和纤维寡糖，消除高浓度纤维二糖和纤维寡糖对葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶的反馈抑制。厚垣镰孢霉HML278所产的葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶酶活较高，β-G的酶活低，比米曲霉HML366先培养48 h，使纤维二糖和纤维寡糖的积累。米曲霉HML366延迟48 h接种，高浓度纤维二糖和纤维寡糖诱导米曲霉HML366产β-G，这两个菌种兼容性好，β-G的酶活在第5 d开始明显增加，第6 d达到最大值,为128.6 U/mL。第6 d β-G的酶活比厚垣镰孢霉HML278单一培养（44.8 U/mL）和米曲霉HML366单一培养酶活（66.6 U/mL）高，混合发酵β-G比米曲霉HML366单一培养酶活提高93.09％。混合发酵酶液FPase的酶活在4 d后开始迅速增加，在第6 d达到最大值,为42.6 U/mL，厚垣镰孢霉HML278单一培养为23.2 U/mL，混合发酵酶活提高了83.62％。第7 d起，活力开始减退，第8 d酶活减退更快。纤维素酶失活可能因为培养时间过长，培养基营养成分不足，蛋白质水解酶水解先期培养的厚垣镰孢霉HML278细胞，导致细胞破碎自溶。3讨论本试验中，经过微波、磷酸和蒸汽爆破预处理蔗渣纤维素后，处理样品的分子间氢键、分子内氢键发生了变化，木质纤维素结构被破坏，木质素、纤维素、半纤维素结构分离，纤维素酶和蔗渣纤维素的可及度提高，厚垣镰孢霉HML278产纤维素酶及半纤维素酶酶活均提高，与未处理材料相比，试验样品滤纸酶活和纤维素蔗渣酶解还原糖提高。米曲霉HML366产β-G具有较高转苷活性，可以合成龙胆二糖，诱导厚垣镰孢霉HML278产生纤维素酶。米曲霉HML366延迟48 h接种酶活较高，厚垣镰孢霉HML278先接种生长48 h后已经能在固体培养基上正常生长，再接种生活力更强的米曲霉HML366，两个菌种不相互抑制，兼容性好。厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵酶液FPase和β-G的酶活均强于单独发酵培养的菌种所产的酶液，混合发酵滤纸酶酶活比厚垣镰孢霉HML278单独发酵提高了83.62％，β-葡萄糖苷酶比米曲霉HML366单一培养酶活提高93.09％。微波技术应用于木质纤维素的预处理，能够改变木质纤维原料分子结构，提高糖化率。蒸汽爆破能够破坏木质纤维素结构，分离木质素、纤维素和半纤维素。部分果胶质和半纤维素等物质在高温高压蒸汽作用下发生化学反应，转化为其他小分子物质，提高纤维素、半纤维素的糖化水解率。4结论米曲霉HML366可以产高转苷活性的β-G，可以合成龙胆二糖，龙胆二糖可以诱导厚垣镰孢霉HML278产纤维素酶。米曲霉HML366和厚垣镰孢霉HML278混合培养产酶效果优于单一菌种产酶效果。