当动物机体氧化防御系统对活性氧等自由基的清除能力无法与其他细胞组织的产生速度达到平衡时，导致活性自由基过量，从而产生氧化应激[1]。多余的自由基参与病原体复制、基因突变、诱发宿主细胞凋亡，使机体引发乳房炎、酮病、子宫内膜炎等疾病[2-4]。目前抗氧化剂主要分为两大类，一种是酶类抗氧化剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等；另一种是非酶类抗氧化剂，主要包括人工合成的抗氧化剂和维生素类。研究发现，抗氧化剂在低剂量使用下表现为抗氧化，高剂量下则为促氧剂，且合成的抗氧化剂对人体具有毒性[5]。抗氧化剂对机体、环境的无副作用尤为重要[6]。目前，荷叶、菊花、山楂、党参等提取物已经作为植物抗氧化剂来源使用[7-9]。艾叶（Folium artemisiae argyi）为菊科蒿属多年生草本植物艾（Artemisia argyi Lévl. et Vant.）的干燥叶，常作药用，具有散寒止痛、温经止血的功效[10]。艾叶主要含有挥发油、酚类、黄酮、多糖及萜类，具有抗菌[11]、抗病毒[12-13]、抗炎[14]等作用。挥发油类成分是从艾叶提取物中分离获得的主要活性物质，是艾叶味道的主要来源，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤以及抗氧化功能[15]。刘涛等[16]、兰晓燕等[17]研究发现，艾叶非挥发油成分含有微量元素、酚类、黄酮、多糖和脂肪酸等。目前，艾叶提取物在动物生产中的应用相对较少。尚喜雨等[18]发现，艾叶提取物能够改善小鼠糖尿病症状，可能与抗氧化应激有关。刘超怡等[19]探究艾叶提取物对禽源大肠杆菌的耐药性和抑菌效果的影响，发现艾叶提取物能够在一定程度上消除禽源大肠杆菌的耐药性，恢复对抗生素的敏感性，可用于防控耐药大肠杆菌的传播。为进一步研究艾叶非挥发性成分的抗氧化活性，本试验使用石油醚去除艾叶中的挥发性成分，采用不同极性的乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水对艾叶逐级提取，应用铁离子还原法（FRAP）及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法考察不同极性提取物的抗氧化能力，测定提取物中多酚、黄酮以及多糖的含量，探究艾叶非挥发性提取物抗氧化活性与多酚、黄酮以及多糖含量的关系，为艾叶非挥发性提取物在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1主要试剂与仪器主要试剂：醋酸铵、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、浓盐酸、氯化铁、Trolox、DPPH、葡聚糖、福林酚、没食子酸标准品、芦丁标准品、乙醇（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、正丁醇（分析纯）。主要仪器：赛多利斯BSA124S电子天平、RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、多功能台式冷冻离心机（艾本德（上海）实验室科技有限公司）；1510-02207全波长酶标仪（赛默飞世尔科技公司）。1.2试验方法新鲜艾叶于65 ℃烘干至恒重，粉碎，过筛。称取100 g干燥粉碎的艾叶，60~90 ℃沸程石油醚按料液比1∶10 g/mL，50 ℃超声辅助提取3次，保留残渣，65 ℃烘干至恒重。根据极性由低到高分别以乙酸乙酯、正丁醇、乙醇及水提取，每种溶剂按料液比1∶10 g/mL超声辅助提取3次，每种溶剂提取后，65 ℃将残渣烘干至恒重，使用下一溶剂提取，分别收集4种溶剂的滤液，减压浓缩至浸膏，得乙酸乙酯相浸膏5.00 g，正丁醇相浸膏1.00 g，乙醇相浸膏11.80 g以及水相粉末15.70 g。1.3测定指标及方法1.3.1抗氧化活性1.3.1.1铁离子还原法（FRAP）将配制好的醋酸缓冲液、TPTZ溶液以及FeCl3·6H2O溶液按10∶1∶1混合，得到FRAP反应液（现用现配）。称取奎诺二甲基丙烯酸（Trolox）配制系列标准液，以Trolox标准溶液浓度（g/L）为横坐标，吸光值（A）为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程：Y=4.103 1 X+0.153 6（R2=0.999 5）。将样品液稀释至标准曲线范围内，取10 μL，加入190 μL FRAP反应液，室温下避光孵育30 min，在593 nm处测定吸光度，每个样品3个重复。1.3.1.21，1-二苯基-2-三硝基苯肼法（DPPH）乙醇溶解DPPH样品，配制DPPH溶液0.1 mmol/L，以Trolox为对照，绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.567 1X-0.518 9，R2=0.996 1。吸取100 μL样品液与等体积（100 μL）DPPH溶液混合，在517 nm处测定吸光度，记为Ai，避光孵育30 min，517 nm处测定吸光度，记为Aj，空白组只加DPPH的乙醇溶液，吸光值记为Ac，每组3个重复，计算清除率。清除率(K)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%(1)1.3.2多酚含量采用Folin-Ciocalteu试剂法测定样品中多酚含量，选用没食子酸（Gallic acid）为标品，配制2 g/L标准液，分别取0、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 mL标准液，使用蒸馏水定容至10 mL，各取1 mL标准液稀释液，分别加入1 mL福林酚（FC）显色剂及3 mL 20% Na2CO3，充分混匀，50 ℃水浴30 min，765 nm测定吸光度。以没食子酸含量（mg）为横坐标，吸光值A为纵坐标绘制标准曲线：Y=0.674 9X-0.010 4（R2=0.997 9）。将样品稀释至标准曲线范围内，取1 mL，重复上述步骤，每个样品3个重复。1.3.3黄酮含量使用NaNO2-AlCl3络合分光光度法测定总黄酮含量，以芦丁（Rutin）作为标品进行定量，配制0.1 g/L芦丁标准液，准确吸取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，使用30%乙醇溶液定容至5 mL，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，放置5 min，加入10% AlCl3 0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液2 mL，使用30%乙醇溶液定容至10 mL充分混合，在510 nm下测定吸光度，以芦丁含量（mg）为横坐标，吸光值A为纵坐标绘制标准曲线，得芦丁标准曲线：Y=0.056 5 X+0.044 3（R2=0.999 9）。将样品稀释至标准曲线范围内，取1 mL，加30%乙醇溶液，定容至5 mL，按上述步骤处理，每个样品3个重复。1.3.4多糖含量使用苯酚硫酸法测定多糖含量，以葡聚糖（Dextean）为标样，配制浓度为0.2 g/L的葡聚糖标准液，吸取0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL标准液于15 mL离心管，蒸馏水补至1 mL，加5%苯酚1 mL及浓硫酸5 mL，摇匀冷却，沸水浴显色15 min，490 nm下测定吸光度，绘制葡聚糖标准曲线，以葡聚糖含量（μg）为横坐标，吸光值A为纵坐标，得葡聚糖标准曲线为Y=1.121 5 X+0.084 9（R2=0.999 7）。样品按倍数稀释至吸光度位于标准曲线范围内，并准确吸取样品液1 mL于15 mL离心管，以1 mL水为空白进行上述同样的处理，每个样品3个重复。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel进行整理，SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，通过皮尔逊相关性分析以及通径分析对数据进行处理。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同提取物对铁离子的还原能力（见图1）测定铁离子在艾叶不同极性提取物中的还原能力，在593 nm波长下，吸光度越高，则铁离子还原能力越强，对应的提取物的抗氧化能力越强。将测得的吸光值代入标准曲线：Y=4.103 1 X+0.153 6（R2=0.999 5），得到Trolox在提取物中的相对含量。由图1可知，水相（DW）中艾叶中Trolox含量最高，可达628.86 mg/100 g。4种提取物对铁离子还原能力从高到低依次为：水相乙醇相正丁醇相乙酸乙酯（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.F001图1不同提取物对铁离子的还原能力注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.2不同提取物对DPPH自由基的清除能力（见图2）对不同提取物进行DPPH自由基清除能力的测定，将吸光值代入清除率方程，所得清除率代入绘制的标准曲线：Y=0.567 1 X-0.518 9（R2=0.996 1），得到Trolox相对含量。由图2可知，水相中Trolox含量最高，正丁醇中Trolox含量最低。4种提取物中清除DPPH自由基能力从高到低依次为：水相乙醇相乙酸乙酯相正丁醇相（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.F002图2不同提取物对DPPH自由基的清除能力2.3不同提取物中没食子酸含量（见图3）采用福林酚法测定4种提取物中多酚含量，将测定吸光度值，代入标准曲线：Y=0.674 9 X-0.010 4（R2=0.997 9），得到不同提取物中没食子酸的相对含量。由图3可知，水相中没食子酸的相对含量最高，其次为乙醇相，含量最低为正丁醇相。4种提取物中，没食子酸含量由高到低依次为：水相乙醇相乙酸乙酯相正丁醇相（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.F003图3不同提取物中没食子酸含量2.4不同提取物中芦丁含量（见图4）通过芦丁比色法测定4种提取物中黄酮含量，将测得吸光度值代入标准曲线：Y=0.056 5 X+0.044 3（R2=0.999 9），得到芦丁在不同提取物中的相对含量。由图4可知，水相的芦丁相对含量最高，乙酸乙酯相含量最低。4种提取物中芦丁含量由高到低为：水相乙醇相正丁醇相乙酸乙酯相（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.F004图4不同提取物中芦丁含量2.5不同提取物中葡聚糖含量（见图5）通过苯酚硫酸法，以葡聚糖为标准品，测定4种提取物中多糖含量。将测得吸光度值代入标准曲线：Y=1.121 5 X+0.084 9（R2=0.999 7），得到4种提取物中葡聚糖相对含量。由图5可知，水相和乙醇相中葡聚糖含量比正丁醇相和乙酸乙酯相的相对含量多。4种提取物中，葡聚糖含量由从高到低依次为：水相乙醇相乙酸乙酯相正丁醇相。除水相与乙醇相葡聚糖含量差异不显著外（P0.05），乙醇相提取的葡聚糖含量显著高于乙酸乙酯相和正丁醇相（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.F005图5不同提取物中葡聚糖含量2.6抗氧化活性与提取物含量的相关性分析FRAP的通径系数及间接通径系数见表1。DPPH的通径系数及间接通径系数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.T001表1FRAP的通径系数及间接通径系数项目与FRAP的相关系数通径系数（P）间接通径系数多酚含量黄酮含量多糖含量合计多酚含量0.986**-0.430—1.271 20.145 81.417 0黄酮含量0.994**1.275-0.428 7—0.147 9-0.280 8多糖含量0.893**0.175-0.358 21.077 4—0.719 2注：“**”表示在0.01水平相关性极显著；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.015.T002表2DPPH的通径系数及间接通径系数项目与DPPH的相关系数通径系数（P）间接通径系数多酚含量黄酮含量多糖含量合计多酚含量0.995**0.103—0.935 2-0.043 30.891 9黄酮含量0.997**0.9380.102 7—-0.043 90.058 8多糖含量0.826**-0.0520.085 80.792 6—0.878 4由表1、表2可知，总酚、黄酮以及多糖含量均与两项抗氧化指标的结果呈极显著正相关，多酚含量与DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力的相关系数分别为0.995、0.986；黄酮含量与两项抗氧化指标的相关系数分别为0.997和0.994，多糖含量与两项抗氧化指标的相关系数分别为0.826和0.893。黄酮含量与抗氧化能力的相关性比其他两项强，总酚含量次之，多糖含量的相关性最弱。由表1可知，黄酮含量的通径系数（P）即直接黄酮含量对FRAP的直接作用最大，多糖含量对FRAP的直接作用最小，黄酮含量的间接通径系数，即黄酮含量对FRAP的间接作用最小，多酚含量的间接通径系数最大由表2可知，黄酮含量关于DPPH的通径系数最大，多糖含量最小，多酚含量关于DPPH的间接通径系数最大，黄酮含量最小。3讨论艾叶具有较强的抗氧化活性，并且抗氧化活性成分较为复杂，各成分的抗氧化能力并不相同。本试验根据溶剂极性的不同，分别对艾叶进行提取，得出不同极性溶剂的提取物。黄梅等[20]研究艾渣不同极性溶剂提取部位的体外抗氧化活性，发现水层还原Fe3+的能力最强。毛跟年等[21]研究发现，艾叶水提物对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，可能是因为艾叶水提物具有较高的抗氧化性有关，与本试验结果相一致。本试验中，艾叶水相中的提取物的抗氧化性显著高于其他3相。袁慧慧等[22]通过正交试验研究艾叶醇-水体系的提取工艺，发现艾叶乙醇提取物具有较强的抗氧化性。本研究表明，艾叶水相提取物对铁离子的还原能力以及DPPH自由基清除能力最高，乙醇相次之，在乙酸乙酯相和正丁醇相中的还原能力均相对较弱，与黄梅等[20]研究结果一致，可能是由于不同极性部位所含化合物种类和含量存在较大差异。多糖、多酚和黄酮是与植物提取物抗氧化活性相关的主要生物活性成分。何柳等[23]在比较艾叶水提物抗氧化性及抗菌作用的研究时发现，总黄酮、总多酚和多糖含量较高，且在后续试验中表明艾叶水提物具有较高的抗氧化活性。为进一步了解提取物中发挥抗氧化活性的主要成分，本试验对不同极性的提取物进行了多酚、黄酮、多糖含量进行测定，结果表明，提取物中的多酚、黄酮以及多糖均在水相中呈现出最高含量，为2.38、0.81、4.46 g/100 g，其抗氧化活性也最高。本研究对抗氧化指标和各项含量进行相关性分析以及通径分析，表明黄酮通过多酚、多糖对FRAP和DPPH的直接作用最大，其次为多酚，最后是多糖。胡倩等[24]研究发现，艾叶的总黄酮提取物能够有效增强秀丽隐杆线虫对外界压力的抗逆性，显著提高线虫体内抗氧化酶活，显著降低MDA含量，与本试验结果相一致。因此，黄酮对FRAP和DPPH主要为直接作用，多糖对FRAP和DPPH的影响主要在于通过黄酮和多酚的间接作用。本研究中多酚的间接作用最大，是由于多酚中包含黄酮类物质。本研究表明，艾叶多糖的体外抗氧化能力与其质量浓度存在一定的量效关系。本研究中多糖的抗氧化活性作用较小，可能是因为本试验处理方式以及艾叶中所含多糖成分不同有关[25]。4结论试验通过浸提法获得艾叶水相、乙醇相、正丁醇相以及乙酸乙酯相的提取物，测定4种提取物抗氧化活性和含量，表明艾叶具有较好的抗氧化性，且提取物主要存在于水相和乙醇相中；艾叶中发挥抗氧化活性的成分主要为黄酮类物质。