甘蔗是生产糖料的主要作物之一[1]。我国每年甘蔗总产量达千万吨[2]。甘蔗叶作为甘蔗收获后的农副产品，被开发利用的比例不高[3]，仅有部分用作动物饲料、肥料[4]和生物乙醇[5]，大多被就地焚烧、腐化，造成严重的资源浪费和环境污染[6-8]。因此，实现甘蔗叶的综合开发利用，提高其使用价值，对甘蔗的种植、深加工具有重大意义。甘蔗叶中含有木质素、有机酸、酚酸及酯类、倍半萜类、多元醇，黄酮、多糖[9]等功能物质。甘蔗叶乙醇提取物具有保肝作用[10]。总黄酮具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等功效。甘蔗叶中多糖具有保护神经、抗心肌梗死和降血糖等作用[11-12]。黄酮类化合物安全、无毒，既是药品又是食品，在医药、食品加工[13]等方面已被广泛应用。离子液体是一种新型的介质和功能化材料[14]，作为绿色溶剂使用时，可显著提高活性成分的溶出率[15]，而且可以循环利用[16]，减少溶剂消耗量，避免环境污染[17-18]。但采用超声波辅助离子液体提取甘蔗叶中总黄酮成分的研究较少。本试验以甘蔗叶为原材料，采用超声波辅助离子液体法提取甘蔗叶总黄酮，对其提取工艺进行优化，为甘蔗叶在饲料方面的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料芦丁标准品（纯度大于98%，批号1225J021）购自北京索莱宝科技有限公司；D-(+)葡萄糖标准品（批号1926178G）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三丁基乙基溴化膦（季鏻类）、N-乙基吡啶四氟硼酸盐（吡啶类）、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（咪唑类）购自中科院兰州化学物理研究所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇等试剂均为分析纯。甘蔗叶于2020年9月在广西上林县采集。1.2试验仪器试验仪器、型号及厂家见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.T001表1试验仪器、型号及厂家仪器名称型号厂家高速万能粉碎机FW100天津市泰斯特仪器有限公司集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S巩义市予华仪器有限责任公司电子天平FA2104B上海越平科学仪器制造有限公司超声波清洗机JP-040深圳市结盟清洗设备有限公司自动平衡离心机LDZ4-2金坛区医疗仪器厂紫外可见分光光度计UV-1780日本岛津红外光谱仪Nicolet Is50美国尼高力仪器公司旋转蒸发仪N-1100上海爱朗仪器有限公司真空干燥箱DZF-6020AB上海力辰邦西仪器科技有限公司智能数显干燥箱202A-0上海昕仪仪器仪表有限公司1.3测定指标及方法1.3.1甘蔗叶的预处理将甘蔗叶剪成小段，鼓风干燥箱50 ℃烘干48 h。将干燥的甘蔗叶粉碎，过80目筛，使用石油醚以1∶10 g/mL于68 ℃恒温回流3 h/次，脱脂2次，抽滤，自然晾干得甘蔗叶粉末。1.3.2标准曲线的绘制参考文献[19]测定总黄酮并进行微调，精密称取芦丁标准品10.00 mg于25 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容，移液器移取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于25 mL棕色容量瓶中，分别加入0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液，振荡摇匀，静置6 min；每个容量瓶中加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液，振荡摇匀，静置6 min；分别向每个容量瓶中加入2.0 mL 4%氢氧化钠，60%乙醇定容，摇匀，避光静置15 min，以相应对照品溶液为空白，按照紫外分光光度法扫描全波长，测其最大吸收波长500 nm并测其吸光度。以浓度c（g/L）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线A=6.191 6c+0.006 5，R2=0.999 7。芦丁标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F001图1芦丁标准曲线1.3.3离子液体对黄酮得率的影响选取三丁基乙基溴化膦（季鏻类）、N-乙基吡啶四氟硼酸盐（吡啶类）1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（咪唑类）对甘蔗叶总黄酮进行超声辅助提取，以黄酮得率为指标，考察离子液体的类型对甘蔗叶黄酮得率的影响。离子液体化学式及分子量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.T002表2离子液体化学式及分子量离子液体化学式分子量三丁基乙基溴化膦C14H32BrP311.28N-乙基吡啶四氟硼酸盐C7H10BF4N194.971-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐C6H11BF4N2197.97分别称取三丁基乙基溴化膦0.62 g、1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐0.40 g、N-乙基吡啶四氟硼酸盐0.40 g于3个容量瓶中，分别加入10 mL去离子水，摇匀得0.1 mol/L离子液体；分别加入1.00 g甘蔗叶粉末摇匀，于超声功率240 W、提取时间15 min、温度45 ℃条件下进行提取，离心取上清液，过0.8 μm微孔滤膜得提取液，测定总黄酮吸光度，计算总黄酮得率。Y=m2/(m1×10)(1)式中：Y为甘蔗叶总黄酮得率（mg/g）；m2为提取液总黄酮的质量（mg）；m1为甘蔗叶粉末质量（g）。1.3.4总黄酮的提取准确称取1.00 g甘蔗叶粉末于容量瓶中，加入一定体积一定浓度的离子液体水溶液，振荡摇匀，超声波振荡清洗器中于超声功率240 W，不同温度、不同时间进行提取，离心取上清液，0.8 μm微孔过滤得提取液。根据1.3.2测得总黄酮吸光度和公式（1），计算总黄酮得率。1.4单因素试验以甘蔗叶提取液中的总黄酮得率和多糖得率为指标，分别对离子液体浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L）、超声时间（20、25、30、35、40、45 min）、液料比（10、15、20、25、30、35 mL/g）、温度40、50、60、70和80 ℃进行单因素试验，确定适宜的试验条件。1.5正交试验优化根据单因素试验结果，设计4因素3水平正交试验，对超声辅助离子液体提取甘蔗叶总黄酮的工艺进行优化。正交试验因素水平设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.T003表3L9（34）正交试验因素水平设计水平超声时间/min离子液体浓度/(mol/L)液料比/(mL/g)超声温度/℃1400.420602450.625703500.830801.6甘蔗叶黄酮的纯化将甘蔗叶黄酮提取液进行旋蒸浓缩，加入3倍体积的无水乙醇，3 ℃冰箱保存24 h，沉淀2次，析出多糖和离子液体，过滤，收集滤液，旋蒸浓缩，加入3倍体积水饱和的正丁醇萃取，萃取3次，合并正丁醇相。将正丁醇相和水相浓缩至一定体积，各取部分浓缩液过0.8 μm微孔滤膜。分别取1.0 mL于25 mL容量瓶中，分别测定正丁醇相和水相总黄酮的吸光度，计算正丁醇有机相和水相的总黄酮含量分布。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1离子液体种类对甘蔗叶总黄酮得率的影响（见图2）由图2可知，三丁基乙基溴化膦对甘蔗叶总黄酮提取效果最好，可能是由于三丁基乙基溴化膦黏度较低[20]，与黄酮分子的氢键作用、静电作用和范德华力更强[21]，从而促进甘蔗叶黄酮溶出。因此，选择三丁基乙基溴化膦进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F002图2离子液体种类对甘蔗叶总黄酮得率的影响2.1.2离子液体浓度对总黄酮得率的影响（见图3）由图3可知，总黄酮得率随离子液体浓度呈先增加后降低的趋势，当离子液体浓度到达0.6 mol/L时，总黄酮得率取得最大值，当离子液体浓度超过0.6 mol/L时，总黄酮的得率大幅度下降，可能是由于离子液体浓度过高，出现了盐析效应，黏度增大[22-23]，导致扩散变弱，抑制了甘蔗叶总黄酮溶出。因此，选择0.4、0.6和0.8 mol/L进行正交优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F003图3离子液体浓度对甘蔗叶总黄酮得率的影响2.1.3超声时间对甘蔗叶总黄酮得率的影响（见图4）由图4可知，随着超声时间的延长，总黄酮得率呈先升高后降低的趋势，30~45 min时的甘蔗叶总黄酮的得率呈上升趋势，在30 min时，总黄酮得率达到最大值3.06%，当超声时间超过45 min，总黄酮得率降低，原因可能是随着超声时间的过长，持续产生热量越大，黄酮的一些热敏性结构遭到破坏和分解[24]，黄酮得率受到影响。因此，选择40、45和50 min进行正交优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F004图4超声时间对甘蔗叶总黄酮得率的影响2.1.4液料比对甘蔗叶总黄酮得率的影响（见图5）由图5可知，液料比10~25 mL/g时甘蔗叶总黄酮得率随液料比增大不断呈上升趋势，可能是因为随着离子液体体积的增多，甘蔗叶粉末与离子液体接触更加充分，从而促进甘蔗叶中总黄酮溶解。在25 mL/g处，总黄酮得率达到最大值，当液料比超过25 mL/g，甘蔗叶总黄酮得率下降，可能是因为甘蔗叶总黄酮在25 mL/g时能够充分溶出，继续增大溶剂体积，减少物料对微波能量的吸收，加大甘蔗叶中其他组分的溶出，导致甘蔗叶总黄酮得率降低。因此，选用液料比20、25和30 mL/g进行优化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F005图5液料比对甘蔗叶总黄酮得率的影响2.1.5超声温度对甘蔗叶总黄酮得率的影响（见图6）由图6可知，甘蔗叶总黄酮得率随温度升高呈不断增大的趋势，在提取温度为70 ℃ 时，得率最高，此后有所下降。较高的温度有利于分子扩散，促进黄酮溶出，但温度过高会导致能耗增加。因此，选取提取温度60、70、80 ℃进行正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F006图6超声温度对甘蔗叶总黄酮得率的影响2.2正交试验结果及验证试验2.2.1正交试验结果（见表4）由表4可知，各因素对甘蔗叶黄酮得率的影响因素次序为：离子液体浓度液料比超声时间超声温度，最佳工艺参数为离子液体浓度0.8 mol/L、液料比25 mL/g、超声时间45 min、超声温度60 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.T004表4正交试验结果项目离子液体浓度/(mol/L)超声温度/℃液料比/（mL/g）超声时间/min总黄酮得率/%10.46020402.8820.47025453.2330.48030503.0840.66020503.0450.67025402.9660.68030452.7370.86020453.4580.87025503.1090.88030403.31k13.0633.1232.9033.035k22.9103.0973.1933.137k33.2873.0403.1633.073R0.3770.0830.2900.087方差分析结果见表5。由表5可知，离子液体浓度和液料比在提取过程中对总黄酮得率影响显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.T005表5方差分析结果项目平方和自由度均方F值显著性离子液体浓度0.21520.107 582.692 3*温度0.01120.005 54.230 8液料比0.15320.076 558.846 2*超声时间0.01220.006 04.615 4误差0.01080.001 3注：F（2，2）=19。2.2.2验证试验结果为验证正交实验设计工艺的可行性，以最优工艺参数离子液体浓度0.8 mol/L、液料比25 mL/g、超声时间45 min、超声温度60 ℃进行3次平行试验，得到甘蔗叶黄酮的得率平均值为3.53%，表明工艺稳定可靠。与韦巧艳等[25]甘蔗叶总黄酮提取量为10.628 mg/g的结果相比，本试验提取出的甘蔗叶总黄酮得率大幅提高，表明与乙醇作为提取溶剂相比，离子液体作为提取溶剂具有优势，能够促进甘蔗叶总黄酮溶出。2.3甘蔗叶总黄酮纯化结果将3次萃取的正丁醇有机相合并，将有机相和水相浓缩至一定体积，各取部分浓缩液经0.8 μm微孔滤膜过滤，分别取1.0 mL置于25 mL容量瓶中，根据测得的正丁醇有机相和水相总黄酮的吸光值，算出正丁醇有机相和水相的总黄酮含量。正丁醇萃取有机相和水相甘蔗叶总黄酮的分布见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F007图7正丁醇萃取有机相和水相甘蔗叶总黄酮的含量分布由图7可知，与水相相比（0.38 g/L），甘蔗叶总黄酮分布更偏向正丁醇有机相（0.48 g/L），可能是因为甘蔗叶总黄酮结构中含有大量羟基。正丁醇萃取纯化后，采用冷冻干燥技术得到正丁醇相的固体粉末，经紫外法显色法测定正丁醇萃取相甘蔗叶总黄酮含量达40.50%，比萃取前高18.65%。2.4甘蔗叶正丁醇相黄酮定性分析2.4.1甘蔗叶正丁醇相黄酮紫外光谱（见图8）由图8可知，甘蔗叶总黄酮出现两个主要特征的吸收峰，峰Ⅰ的波长范围为300~400 nm，主要是因为黄酮类化合物的基本结构的黄酮B环和环肉桂酰系统引起；峰Ⅱ的吸收峰在500 nm处存在，与芦丁的在紫外-可见光中最大的吸收波长接近；两处吸收峰与芦丁标准品相似，甘蔗叶总黄酮紫外-可见光谱与芦丁标准品相吻合，表明该纯化物质为黄酮类化合物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F008图8甘蔗叶正丁醇相黄酮紫外光谱2.4.2甘蔗叶正丁醇相黄酮红外谱（见图9）由图9可知，甘蔗叶总黄酮在400~4 000 cm-1波数范围内有多处吸收峰。在3 500~3 200 cm-1波数范围内出现一个强烈并且宽的吸收峰，甘蔗叶总黄酮的吸收峰为3 407 cm-1，这是由于缔合O-H基的伸缩振动，表明存在酚羟基；甘蔗叶总黄酮在波数为2 935 cm-1的吸收峰为—CH2反对称伸缩振动引起；1 606 cm-1为C=O的伸缩振动吸收引起；C—O的伸缩振动吸收区域主要为1 300~1 000 cm-1波数范围内，因此1 266 cm-1、1 057 cm-1为C—O的伸缩振动引起，可判断由于C—O键存在；785 cm-1处的吸收峰是由苯环间位取代的面外变形振动引起的；820 cm-1处的吸收峰为苯环对位取代引起[13]；1 000~650 cm-1为芳香环的不饱和C-H键的面外弯曲振动吸收峰γ=C—H。因此，可初步判断该纯化后物质为黄酮类化合物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.14.021.F009图9甘蔗叶正丁醇相黄酮红外谱3结论提取甘蔗叶总黄酮最优提取离子液体为三丁基乙基溴化膦；最佳工艺参数为离子液体浓度0.8 mol/L、液料比25 mL/g、超声时间45 min、超声温度60 ℃，该条件下甘蔗叶黄酮的得率平均值为3.53%。采用正丁醇对甘蔗叶总黄酮进行萃取纯化，纯化后甘蔗叶总黄酮含量达40.50%。