卵母细胞的体外成熟是体外受精和体外胚胎发育的基础，与之后的受精率和囊胚发育率直接相关，是体外胚胎生产中最为关键的一步。为进一步提高牛卵母细胞的体外成熟技术，已有学者从激素[1]、微量元素[2]、生长因子[3]、培养模式[4]等方面进行了大量研究，但在基础液的选择与使用上仍较为单一[1-4]。试剂A是一种同时可应用于卵母细胞体外成熟和细胞培养的基础液，尚未见相关报道。卵母细胞在体外成熟时是卵丘-卵母细胞共培养状态，有研究表明，卵母细胞的成熟质量与卵丘细胞发育的良好程度具有一定关联[5-6]。因此，利用试剂A进行牛卵母细胞的体外成熟，或许能够同时促进卵丘细胞和卵母细胞的发育，进而获得一定的体外胚胎发育效果。此外，因从屠宰场获取限定条件下的试验材料难度较大，为方便试验或生产，也有研究探索了不同卵巢保存温度在牛体外胚胎发育方面的影响[7-10]，结论虽不完全一致，但均表明一定范围内，不同卵巢保存温度会对牛体外胚胎生产造成一定影响。因此，在仅进行体外胚胎生产且不做其他因素考虑时，可对卵巢采用非限定温度的保存方式。关于牛卵巢的常温保存少有报道，但已有研究表明猪卵巢的常温保存仍具良好的试验效果[11-12]。研究对试剂A和卵巢常温保存体外培养进行了相关试验，以期为相关研究及生产应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用卵巢采集自沈阳市沈北新区某个体屠宰场。试剂除试剂A、试剂B、M199（赛默飞世尔科技）、IVF-100受精液（Research Institute for the Functional Peptides）、胎牛血清（FBS，南京森贝伽生物有限公司）以及卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH，宁波三生制药）外，均购自Sigma公司。HERAcell®150 i CO2培养箱、单人超净工作台（苏州净化设备有限公司）；水浴锅（常州迈科诺仪器有限公司）、恒温加热台（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、电子天平（赛多利斯公司）、5702离心机（eppendorf公司）。1.2卵母细胞的采集无菌手术剪刀去除卵巢周围多余组织，含双抗的37 ℃生理盐水清洗5~6遍。取单个卵巢，吸取表面多余水分，以带9号针头的10 mL无菌注射器抽取表面直径为2~8 mm卵泡的卵泡液于直径120 mm的细菌培养皿。采卵液为M199+5% FBS+30 mg/L肝素钠+4.766 g/L Hepes缓冲剂。每抽取5~6个卵巢捡卵一次，挑选具有3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）用于体外成熟。1.3试验方法1.3.1试验设计1.3.1.1不同试剂对牛体外胚胎发育的影响分别选用试剂A和试剂B作为基础成熟液进行牛卵母细胞的体外成熟。添加成分均为10% FBS、0.01 IU/mL FSH、0.02 IU/mL LH和1 mg/L 雌二醇（E2）。卵巢保存条件均为37 ℃加双抗生理盐水的保温杯。1.3.1.2卵巢常温保存对牛体外胚胎发育的影响分别采用常温（空气温度测定值为23 ℃）及37 ℃加双抗生理盐水的保温杯进行卵巢保存。运输时间均为1 h以内，卵母细胞体外成熟所使用的液体均为试剂B。1.3.2体外成熟每捡完一次卵，将挑选的COCs于成熟液中洗3遍，之后每40个左右移入平衡至少2 h的成熟液中进行卵母细胞的体外成熟。成熟方法为四孔板法，成熟条件为38.5 ℃、5% CO2的饱和湿度，培养时间为22~24 h。1.3.3精子的洗涤细管冻精在37 ℃水浴锅中解冻后，置于含6 mL受精液的离心管中，2 000 r/min离心7 min，弃去上清液后重复洗涤1次。洗涤好的精子采用受精液稀释至密度为1×106~6×106 个/mL，于CO2培养箱中培养10 min。1.3.4体外受精卵母细胞体外成熟22~24 h，受精液中洗3遍，10枚/组移入平衡至少2 h的50 µL受精微滴中，加入50 µL的洗涤后备用精子，于CO2培养箱中进行体外受精。受精条件为38.5 ℃、5% CO2的饱和湿度，受精时间为6 h。1.3.5体外培养体外受精5~6 h，将假定的受精卵于胚胎培养液CR1aa[13]中洗3遍，1 mL移液枪去除周围部分卵丘细胞及精子，受精卵10枚/组移入平衡至少2 h的含100 µL培养液的微滴中进行体外培养。培养条件为38.5 ℃、5% CO2的饱和湿度。从体外受精开始算起，第48 h观察卵裂率，第7~8 d统计囊胚发育率，中途不换液。每组试验重复3次。1.4数据统计与分析试验数据用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，LSD、Duncan's法进行双侧检验，非齐性采用Dunnett's C进行检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同试剂对牛体外胚胎发育的影响（见表1）由表1可知，试剂A的卵裂率与试剂B相比差异不显著（P0.05），但囊胚率显著低于试剂B（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.004.T001表1不同试剂对牛体外胚胎发育的影响Tab.1Effect of different reagent on bovine embryo production in vitro组别卵母细胞数/个卵裂数/个卵裂率/%囊胚数/个囊胚率/%试剂B25.00±8.2518.00±9.0669.44±11.286.75±3.5937.38±2.89a试剂A9.75±0.506.50±0.5866.67±4.711.25±0.5019.04±6.45b注 ：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2不同卵巢保存温度对牛体外胚胎发育的影响（见表2）由表2可知，常温（23 ℃）保存条件下的卵裂率与37 ℃条件保存下的卵裂率差异不显著（P0.05），但囊胚率显著低于37 ℃保存条件（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.004.T002表2不同卵巢保存温度对牛体外胚胎发育的影响Tab.2Effect of different ovarian storage temperatures on bovine embryonic development in vitro组别卵母细胞数/个卵裂数/个卵裂率/%囊胚数/个囊胚率/%37 ℃21.33±4.6213.67±3.2163.89±2.415.00±1.0036.94±3.37a常温11.67±3.797.67±2.0866.39±3.761.67±0.5821.75±6.14b3讨论3.1不同试剂对牛体外胚胎发育的影响本试验结果显示，试剂A获得了19.04%的囊胚率，表明试剂A也可应用于牛体外胚胎生产体系的建设。试剂A是一种主要应用于细胞分离及培养的基础液，但也具有应用于卵母细胞体外成熟基础试剂的效果。本试验中试剂A的卵裂率与试剂B差异不显著，但囊胚发育率却显著降低，可能由于试剂A与常用的牛卵母细胞体外基础成熟液相比，添加的是氨基酸成分，缺少了部分利于卵母细胞体外成熟的因子，进而影响卵母细胞体外成熟的质量以及胚胎的后续发育。牛卵母细胞体外成熟的质量与后续受精卵的发育具有直接的关联性，与本研究结论一致[5-6]。此外，试剂A是一种可用于细胞培养和卵母细胞体外成熟的液体，而卵母细胞的体外成熟通常是卵丘-卵母细胞复合体的形式。颗粒细胞单层有助于牛卵母细胞的体外成熟，而培养的细胞具备上述功能主要通过卵丘-卵母细胞连接通道进行[6]。本试验中试剂A有助于卵丘细胞的发育，原因可能是该功能进一步促进了卵母细胞的体外成熟。但试剂A的囊胚率及胚胎的后续发育均不如试剂B，间接表明了细胞共培养有助于卵母细胞体外成熟质量的提升，但并非关键因素。综上所述，试剂A也可应用于牛体外胚胎生产体系的建立，但效果有待进一步提高。3.2常温保存对牛体外胚胎生产体系的影响牛卵巢的保存温度与运输时间有关，一般运输时间在4 h内时，保存温度为37 ℃，运输时间越长，相对的保存时间越低。为研究常温保存下的胚胎生产效果，试验选择37 ℃保存条件做对照，结果显示，常温保存获得了21.75%的囊胚率，表明牛卵巢常温保存可实现体外胚胎生产。但与37 ℃保存条件相比，常温保存的囊胚率显著降低，表明卵巢的保存温度可显著影响体外胚胎的后续发育。因常温保存存在温度不确定性，故仅建议常温保存应用于一定条件下的体外胚胎生产，不建议应用于其他因素的分析。本试验显示，卵巢的常温保存与37 ℃保存的卵裂率差异不显著，表明温度对体外胚胎生产的表面影响主要在卵裂后期，与前人结论一致[7-8]。卵巢是卵母细胞的载体，温度对卵巢的影响即为对卵母细胞的影响。但无论卵巢保存在4、10 ℃[9-10]，还是20~25、30~38 ℃[7-9]，其成熟率和卵裂率均不低，且可获得一定的囊胚率，表明卵巢保存温度并非牛体外胚胎生产的决定性因素。目前研究的温度范围内，卵母细胞均具有一定的承受能力，故在只考虑生产牛体外胚胎不做其他因素考虑的情况下，可采用常温保存的便捷方式获取试验材料。4结论试剂A可应用于牛体外胚胎的生产，但囊胚率低于试剂B。牛卵巢采集可在常温下进行，但温度对受精卵的后续发育影响较大，进行对比试验时需考虑该因素的影响。