丁酸梭菌是一种在厌氧条件下生长的微生物，是芽孢杆菌科梭菌属的一种革兰氏阳性菌，于2009年被批准为新饲料添加剂，开始应用于国内市场[1]。丁酸梭菌生长过程中代谢产生了乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等多种有机酸[2-3]，其中丁酸对肠道上皮组织的再生修复具有重要意义[4-5]。丁酸可修复肠黏膜，降低肠道pH值，而较低的肠道pH值更适合益生菌生长增殖[6-7]。王康莉[8]研究发现，丁酸梭菌及其代谢产物可显著提高断奶仔猪空肠绒毛高度，减少炎症因子分泌，并通过调节肠道微生物区系维持肠道健康。目前，丁酸梭菌在肉鸡养殖方面多采用活菌粉饲喂的方式进行试验。如Zeng等[9]开展了丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌复合益生菌粉（1010~1011 CFU/kg）饲喂试验，发现肉鸡末重和血清总蛋白显著增加。Takahashi等[10]研究发现，以丁酸梭菌MIYAIRI 588（2.5×105 CFU/g）饲喂肉鸡，可使平均日增重提高2%，肉鸡生长性能得到显著改善。丁酸梭菌代谢产物对肉鸡生长的影响研究较少，且基于菌液方便用于饮水的因素考虑，本试验通过进行丁酸梭菌发酵培养基的优化，并进行饮水试验评价其对肉鸡生长性能的影响，为高丁酸含量的丁酸梭菌液在肉鸡养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料丁酸梭菌为山东蔚蓝生物科技有限公司保藏菌种。主要试剂：强化梭菌培养基（北京陆桥技术股份有限公司）；可溶性淀粉、一水葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；酵母粉、蛋白胨（均为试验用生化试剂，OXOID公司）；乳酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正己酸（均为试验用色谱试剂，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。主要仪器：洁净工作台（青岛海尔生物医疗公司）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；L530型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；Waters-2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）。1.2试验方法1.2.1丁酸梭菌活化扩培吸取甘油管中保存的丁酸梭菌液500 μL，接种于100 mL灭菌的强化梭菌培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，获得丁酸梭菌扩培菌液。1.2.2丁酸梭菌发酵液制备可溶性淀粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO4 5 g/L、KH2PO4 0.1 g/L、酵母粉15 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L、pH值为7.0±0.1。接种量为5%，37 ℃厌氧培养48 h，10 000 r/min离心10 min，取上清。1.2.3丁酸梭菌发酵产丁酸优化单因素试验选择培养基的碳源、氮源、发酵初始pH值开展单因素试验。在其他组分和培养条件不变的前提下，分别以可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、初始pH值进行单因素试验研究。单因素试验设计见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T001表1单因素试验设计Tab.1Single factor test design序号可溶性淀粉/(g/L)葡萄糖/(g/L)酵母粉/(g/L)初始pH值150106.02105156.531510207.042015257.552520308.01.2.4丁酸梭菌发酵产丁酸优化正交试验在单因素试验的基础上，以可溶性淀粉（A）、葡萄糖（B）和发酵初始pH值（C）为研究对象，采用L9（34）正交试验优化丁酸梭菌发酵条件，通过极差分析和SPSS方差分析[11]，确定该菌代谢分泌丁酸的发酵最优条件。L9（34）正交试验因素水平设计见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T002表2L9（34）正交试验因素水平设计Tab.2L9 (34) orthogonal test factor levels design水平A/(g/L)B/(g/L)C13056.5220107.0310157.51.2.5高效液相色谱（HPLC）定量检测有机酸Waters-2695型高效液相色谱仪，检测器为紫外检测器，kc-811色谱柱。丁酸梭菌离心上清液，经过0.1 μm的水系滤膜过滤进行有机酸测定。测定条件为：流速0.8 mL/min；柱温40 ℃；波长210 nm；流动相：0.1%磷酸水溶液。1.2.6饮水添加丁酸梭菌液对肉鸡生长性能的影响选取150只健康1日龄白羽肉鸡，随机分为3组，每组5个重复，每个重复10只鸡，开展42 d的饮水试验评价，试验设计见表3。基础日粮采用玉米-豆粕型日粮，日粮配方设计参考《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004），基础日粮组成及营养水平见表4。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T003表3饮水试验设计Tab.3Drinking water trial design组别处理方式使用量对照组正常饮用水+基础日粮—试验组1优化前的丁酸梭菌液+基础日粮2 L/t菌液试验组2优化后的丁酸梭菌液+基础日粮2 L/t菌液XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T004表4基础日粮组成及营养水平Tab.4Basic diet composition and nutritional level项目1~21日龄22~42日龄原料组成/%玉米64.4066.50豆粕26.5027.00玉米蛋白粉4.002.00磷酸氢钙2.001.70石粉1.201.10蛋氨酸0.300.20赖氨酸0.300.20氯化钠0.300.30预混料1.001.00合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.4013.02粗蛋白质/%20.9719.06蛋氨酸/%0.620.47赖氨酸/%0.970.89钙/%1.050.98总磷/%0.820.71注 ：1.预混料为每千克日粮提供：VA 10 000 IU、VD3 2 000 IU、VE 10 IU、VK3 2.5 mg、VB1 1 mg、VB2 6 mg、VB3 10 mg、VB5 40 mg、VB6 3 mg、VB11 0.3 mg、VB12 0.01 mg、生物素0.12 mg、Fe 60 mg、Cu 10 mg、Zn 80 mg、Mn 85 mg、I 0.3 mg、Se 0.15 mg。2.营养水平均为计算值。试验开始第1 d和结束第2 d，以重复为单位空腹称重（称重前12 h断料），统计耗料量，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。每日早、晚观察试验鸡的健康状况。1.2.7数据统计与分析试验数据采用Excel 2016软件进行初步整理，SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1有机酸标准品色谱图（见图1）由图1可知，乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和己酸的保留时间为10.359、11.953、13.695、16.385、33.356。各组分峰形良好，基线稳定，该方法可应用于上述有机酸的检测。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.F001图1有机酸标准品色谱图Fig.1Organic acid standard chromatogram2.2丁酸梭菌初始发酵培养基产酸情况分析（见表5）由表5可知，丁酸梭菌经过液体发酵，主要代谢产生了乳酸、乙酸和丁酸等3种有机酸，含量分别为0.414、1.441、2.803 g/L，丙酸和己酸产生较少，活菌计数为1.05×108 CFU/mL。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T005表5丁酸梭菌初始发酵培养基产酸情况分析Tab.5Analysis of acid production in initial fermentation medium of项目乳酸乙酸丙酸丁酸己酸含量0.4141.4410.0032.8030.021Clostridium butyricum 单位：g/L2.3丁酸梭菌发酵优化单因素试验结果（见图2）由图2可知，随着可溶性淀粉含量提高，代谢物丁酸产量升高；当可溶性淀粉含量为20 g/L时，产生的丁酸含量达到最高；之后继续提高可溶性淀粉含量，产生的丁酸含量略有降低。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.F002图2丁酸梭菌发酵优化单因素试验结果Fig.2Single factor test result of fermentation optimization of Clostridium butyricum当葡萄糖含量达到10 g/L时，代谢产生的丁酸含量最高。随着酵母粉含量增加，代谢产物变化平缓，其原因可能是现有的酵母粉添加量已满足试验需求，再提高其含量对发酵帮助不大。当发酵初始pH值在6.0~7.5范围内时，代谢产生的丁酸含量有所不同；当pH值在7.0的中性条件时，代谢物产量最高；pH值达到8.0时，代谢物丁酸含量极少，该pH值条件下不适于丁酸梭菌生长。综上所述，进一步选择可溶性淀粉、葡萄糖和发酵初始pH值进行正交试验优化。2.4丁酸梭菌发酵优化正交试验结果（见表6、表7）发酵其他条件不变，经过对培养基中可溶性淀粉、葡萄糖和发酵初始pH值的正交试验优化。由表6可知，通过极差分析，菌体发酵代谢生成丁酸的影响因素由大到小依次为ABC。最优组合为A2B2C3，即可溶性淀粉20 g/L、葡萄糖10 g/L、初始pH值为7.5。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T006表6L9（34）正交试验结果Tab.6L9 (34) orthogonal test result试验号ABC空列丁酸/(g/L)111113.321212235.207313324.283421336.320522127.832623216.362731223.209832314.976933132.551K112.81112.85013.70414.658K220.51418.01514.77814.079K310.73613.19615.57915.324k14.2704.2834.5684.886k26.8386.0054.9264.693k33.5794.3995.1935.108R3.2591.7220.6250.415由表7可知，通过SPSS进行方差分析，结果与极差分析一致，可溶性淀粉和葡萄糖对代谢产酸具有显著影响（P0.05）。根据正交试验获得的产丁酸的最优组合A2B2C3进行验证试验，丁酸含量为8.050 g/L，活菌计数为1.27×108 CFU/mL；经过正交试验优化，丁酸梭菌代谢丁酸的水平与初始发酵培养基相比提高了2.87倍。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T007表7L9（34）正交试验结果方差分析Tab.7L9 (34) orthogonal test optimization and result analysis项目Ⅲ类平方和自由度均方F值P值修正模型23.866a63.97831.1200.031截距215.4271215.4271 685.3920.001A17.73228.86669.3620.014B5.55222.77621.7200.044C0.58220.2912.2770.305误差0.25620.128总计239.5499修正后总计24.1228注：R2=0.989（调整后R2=0.958）。2.5饮水添加丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响（见表8）由表8可知，1~21日龄，与对照组相比，试验组1和试验组2肉鸡的腹泻率显著降低（P0.05）。22~42日龄，与对照组相比，试验组1和试验组2肉鸡的料重比和腹泻率均显著降低（P0.05）；且试验组2腹泻率最低，显著低于试验组1（P0.05）。1~42日龄，与对照组相比，试验组1和试验组2肉鸡的料重比和腹泻率均显著降低（P0.05）；且试验组2腹泻率最低，显著低于试验组1（P0.05）。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.08.008.T008表8饮水添加丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响Tab.8Effect of Clostridium butyricum supplementation in drinking water on growth performance of broilers项目对照组试验组1试验组21~21日龄初重/g40.91±1.3541.08±1.6741.01±1.48末重/g770.03±10.22762.43±15.72795.32±12.87平均日采食量/[g/(只·d)]54.30±2.2053.91±2.6154.18±2.38平均日增重/[g/(只·d)]34.72±1.8734.35±1.3235.92±1.16料重比1.56±0.161.57±0.021.51±0.25腹泻率/%3.12±0.24a2.65±0.20b1.82±0.05c22~42日龄末重/g2 100.37±43.752 235.07±73.632 277.40±85.25平均日采食量/[g/(只·d)]131.77±2.90129.74±3.12130.57±3.26平均日增重/[g/(只·d)]63.35±2.9470.13±3.1170.58±3.18料重比2.08±0.02a1.85±0.14b1.85±0.10b腹泻率/%2.30±0.15a1.99±0.11b1.50±0.03c1~42日龄平均日采食量/[g/(只·d)]89.42±5.5289.57±5.2389.76±5.80平均日增重/[g/(只·d)]49.03±2.1552.24±2.3153.25±2.18料重比1.82±0.16a1.71±0.20b1.68±0.19b腹泻率/%2.71±0.22 a2.32±0.12 b1.66±0.11 c注 ：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。综上所述，在42 d饲喂试验中，与对照组相比，试验组2肉鸡的料重比和腹泻率有所改善，效果显著。3讨论3.1丁酸梭菌发酵产酸优化丁酸梭菌可提高动物生长性能和免疫功能[12]，发酵过程中代谢产生乳酸、乙酸和丁酸等多种有机酸，其中乳酸和乙酸常用于降低饲料pH值[13]，减少饲料中腐坏微生物污染[14]。代谢产物丁酸在肠道上皮细胞的再生和修复中发挥着重要作用，提高菌株发酵液中代谢产生丁酸的水平有助于提升该菌应用过程中的益生作用。傅云扉等[15]综述了丁酸梭菌基因工程改造进展，旨在探索分子水平改造提高产丁酸代谢能力的新思路。本文采用发酵工程技术方法，对发酵原料和发酵参数控制的正交优化，获得了此株丁酸梭菌更高效发酵分泌丁酸的培养基；经发酵验证，摇瓶发酵液中丁酸含量提高到8.050 g/L，高于张楠等[16]发酵的丁酸7.3 g/L的含量。3.2丁酸梭菌对肉鸡生长性能的影响郑爱娟等[17]研究发现，日粮中添加2.5×108 CFU/kg丁酸梭菌菌粉可显著提高42日龄肉鸡血清总蛋白、白蛋白和球蛋白的含量，促进家禽对饲料的利用，提高机体营养物质的吸收，提高肉鸡生长性能。徐明霞[18]研究发现，日粮中添加400 g/t丁酸梭菌改善肉鸡生长性能的效果最佳，试验组肉鸡的末重显著高于空白对照组，与本试验中试验组2肉鸡末重最高的结论一致。本试验采用丁酸梭菌发酵的菌液进行饮水试验，除活菌外还含有多种代谢产物有机酸，尤其试验组2的菌液经过发酵优化，对肉鸡的腹泻率具有显著的改善作用。原因可能是其产生代谢产物的能力，可调节肠道pH值，抑制病原菌，从而调整细菌群落结构[19]。Verma等[20]研究发现，丁酸梭菌可提高乳酸菌的相对丰度，乳酸菌可预防试验模型动物的结肠炎症发生，缓解腹泻情况。4结论近年来，饲用丁酸梭菌的工业发酵生产发展迅速，极大地促进了其在动物养殖业中的推广。丁酸梭菌发酵过程代谢产生的丁酸对动物的益生性能突出，不仅可保护肠道功能，还利于平衡肠道微生物菌群。本试验借助HPLC定量分析方法，提高了饲用丁酸梭菌代谢生产丁酸的水平；在饮水试验中，含有丁酸8.050 g/L的菌液可显著改善肉鸡生长性能，利于动物养殖的肠道健康，也可助力绿色生态养殖的发展。