应激会对家畜生产造成严重的负面影响。准确判断家畜是否处于应激状态是确定应激源、降低或消除应激源刺激的前提。目前，通过血清和血浆中的相关应激激素浓度及酶活性变化情况是判断应激程度最常用的方法。但在采血时，由于采样人员的操作手法生疏等原因，极易造成采血失败，而多次重复采血会对试验动物造成伤害，使动物出现一些不良的应激反应[1]。因此，会对判断动物应激的结果产生一定干扰，造成的二次应激会影响动物健康和生产。通过观察动物的行为确定动物是否处于应激状态也是一种较为常用的方法。这种方法需要研究人员通过直接观察记录或录制的视频抽取有效数据，分析动物应激状态。此过程中人工判断容易出现误差，并且目前已有的动物行为分析软件的准确度和有效性均存在一定疑问。另外，也可通过环境指标判定动物是否处于应激状态。如可根据温湿指数（THI）和风冷却指数（WCT），判断动物是否处于冷热应激[2]。这些环境指标可以辅助判断应激状态，但这种方法无法具体到某一个体，需要配合其他方法对应激程度进行判断。动物唾液中的应激相关指标水平的变化可以很好地反应动物的生理及心理状况。本文综述唾液嗜铬粒蛋白A（CgA）、唾液α-淀粉酶（sAA）和唾液皮质醇（Cor）的研究进展及其能否用于判断家畜急性应激，为通过动物唾液中的应激相关指标判断动物应激状态提供参考。1唾液中的应激生物标记物高等动物的唾液由口腔内的3对唾液腺（腮腺、下颌腺和舌下腺）和口腔黏膜中许多分散的小腺体的分泌物混合组成，这种唾液被称为全唾液[3]。关于反刍动物唾液的研究较早[4]。绵羊的唾液由98.92%的水和少量无机盐和有机物组成，还包括一些生物活性物质，但具体成分与饲料种类有关[5-6]。反刍动物唾液分泌量与采食、反刍时间呈正相关，成年绵羊每天大约可以分泌7 L唾液[7]。唾液中的生物活性物质经反刍进入瘤胃，可以影响瘤胃微生物的活性，进而影响饲料在瘤胃内的发酵和代谢。唾液中的少量激素还可以影响瘤胃中的酶活性[8]。通过对反刍动物唾液的研究，可以在一定程度上反映瘤胃内的健康情况和家畜的应激状态。唾液嗜铬粒蛋白A、唾液α-淀粉酶、唾液皮质醇等唾液生物标记物可以判断家畜的应激程度。1.1唾液嗜铬粒蛋白A唾液嗜铬粒蛋白A（CgA）是一种酸性蛋白，广泛存在于动物的神经内分泌系统中，在人类医学领域常作为诊断内分泌肿瘤的可靠标志物[9]。唾液中的CgA由颌下腺导管系统中具有分泌功能的节段合成，贮存在腺泡的分泌颗粒中，通过胞吐作用进入唾液[10]。在细胞中主要负责神经递质和包括儿茶酚胺等内分泌激素的聚集，也是一些生物活性肽的前体物质[9]。儿茶酚胺属于一种CgA蛋白降解产物，还是一种典型的应激激素[11]，其浓度上升被认为是交感肾上腺髓质系统（SAM轴）的激活标志，对判断动物体的应激状态具有重要作用。目前，儿茶酚胺的检测技术主要适用于血液样品，唾液中的儿茶酚胺浓度较低，能够迅速降解，无法反映儿茶酚胺在血液中的浓度，很难达到试验目的。目前测量唾液样品中的儿茶酚胺浓度的方法程序较复杂，需要对采集的唾液样品进行一系列预处理[12]。因此，在畜牧生产中常用儿茶酚胺的前体物质（唾液CgA浓度）判断动物体的应激状态。唾液腺由交感和副交感神经系统支配，表明唾液中CgA浓度会随着应激程度变化而改变[13]。在人类研究中，Kang等[14]和Yoto等[15]研究表明，可以用唾液CgA浓度变化判断人类的精神压力；压力越大，唾液CgA浓度越高。在动物研究中，可通过唾液CgA浓度判断猪和狗的应激程度及疾病，而在反刍动物中的研究较少[16-17]。Casal等[18]通过不同饲粮对断奶仔猪产生应激进行对比，表明唾液CgA可作为一种可靠的猪急性应激生物标记物。Escribano等[19]使用猪建立心理社会应激源模型后，与未应激的对照组进行对比，结果表明，应激组猪的唾液CgA浓度显著升高。Srithunyarat等[20]研究表明，随着应激程度加深，犬的唾液CgA浓度上升，其下游产物浓度也在显著上升，表明CgA作为犬应激生物标志物的临床可行性。唾液中CgA不易受外界环境的影响，能够在唾液样品中存在较长时间，因此比较适用于慢性应激的检测[21]。CgA作为一种唾液蛋白，在机体受到急性刺激时，唾液中的蛋白指标变化最快[21]。因此，唾液CgA可以用于判断各种应激的程度。但唾液CgA作为应激生物标记物在应用中还存在一些不足。唾液CgA浓度受到生物节律的影响。因此，在使用唾液CgA作为判断指标时应特别注意取样的时间[22]。唾液CgA浓度会受口腔疾病的显著影响[23]。因此，在使用唾液CgA作为判断指标时，应首先判断试验动物口腔是否健康。因此，唾液中CgA浓度可以作为单胃动物判断应激程度的生物标记物之一，随着应激程度加重，唾液中CgA浓度会上升。CgA作为一种神经内分泌系统的标志物广泛分布于全身各部[24]。Vittoria等[25]采用组织化学和免疫荧光双标技术在羊的尿路上皮中检出含有CgA的神经内分泌细胞，但目前尚未在反刍动物唾液中检出CgA，CgA是否可以在反刍动物应激试验使用还需要进一步探索。1.2唾液α-淀粉酶唾液α-淀粉酶（sAA）是一种由唾液腺分泌，具有分解糖类糖苷键功能的水解酶。在交感神经兴奋时，短时间分泌量可以迅速升高[26]。因此sAA分泌量和活性可以反映主要由交感神经支配的急性应激反应。sAA作为一种唾液标记物在人类医学领域研究最为广泛[27]。研究表明，人的心理压力越大，sAA的水平越高[28-29]。在判断心理问题时，可以通过sAA水平提高心理问题诊断的准确性。在动物生产中，关于单胃哺乳动物的sAA研究较深入，但对于反刍动物的研究处于初步阶段。López-Martínez等[30]通过鼻套束缚试验构造母猪急性应激模型，对唾液样本进行分析，结果发现，唾液中sAA活性上升，唾液中的D-二聚体水平显著上升，表明sAA活性上升与急性应激引发的SAM轴激活有关。Contreras-Aguilar等[28]对马的sAA与应激的关系进行研究，发现在增加马的运动强度之后，唾液中sAA活性显著增加，因此sAA活性可以用于评价运动引起的应激程度。Broche等[29]通过对日本猕猴进行试验，经过急性应激测定sAA活性，发现sAA活性在应激后迅速增强，不久后恢复至正常水平。Contreras-Aguilar等[31]对奶牛产前产后唾液sAA活性进行了研究，结果发现，奶牛唾液sAA水平在产后上升，这说明奶牛在生产时的疼痛造成了急性应激，激活了SAM轴，造成sAA活性上升。Fuentes-Rubio等[32]建立了一种用于测定绵羊sAA的时间分辨免疫荧光测定法（TRIFMA），并用绵羊束缚试验进行验证，结果表明，应激诱导后绵羊唾液中sAA浓度极显著升高。Contreras-Aguilar等[33]在绵羊唾液的潜在应激标记物的研究中，将sAA作为一种公认的应激标记物来进行对照，寻找潜在的应激生物标记物，表明唾液中sAA可以作为一种很好的绵羊应激唾液标记物。在人类医学研究中发现，sAA浓度受生物节律和性别年龄的影响[34]。Contreras-Aguilar等[35]研究表明，犬sAA浓度上升与交感神经的激活有关。因此，动物的sAA浓度同样会受生物节律的影响。因此需要试验人员在正式试验前进行预试验，确定待测动物的生物节律及动物sAA在正常情况下的浓度基线。这样可以更准确选择最佳采样时间，判断试验时的浓度波动是因为生物节律还是由于SAM轴的兴奋导致。因此，sAA作为应激生物标记物适用于判断SAM轴参与的各类应激程度，为唾液可能成为监测动物健康和福利的生物标志物提供参考。1.3唾液皮质醇皮质醇（Cor）是下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA轴）的主要作用物质，分为内源Cor和外源Cor。虽然急性应激主要作用的分泌轴是SAM轴，但有一部分急性应激的应答也要依靠HPA轴的响应。内源Cor是一种代谢在肝肾的胆固醇衍生物，在应激源刺激下经下丘脑垂体传递作用于肾上腺皮质束状带而分泌[36]。外源性Cor是指在体外人工合成，用于治疗过度免疫而造成的疾病的各种药物[37]。Cor能够动员细胞中氨基酸和脂肪，使其转化为能量[38]，在机体抗应激过程中具有重要作用。Cor经血液进入体循环后，约90%与皮质类固醇结合球蛋白（CBG）集合，少量与白蛋白结合，剩余10%左右以游离态形式存在，具有较强的生物活性[36,38]。游离Cor广泛存在于体液中，其中游离至唾液中的Cor浓度和血清Cor浓度的正相关性最强[39]。在现代医学发展过程中，人们对于唾液Cor的研究比较全面，目前人类的唾液Cor含量主要应用于心理压力及抑郁程度的辅助评定[40]和检测库欣综合征（CS）[41]。在犬的福利研究中，唾液Cor浓度的应用最广泛。Cobb等[42]确定了非应激情况下狗唾液Cor浓度的参考范围，犬的唾液Cor浓度与性别、年龄、绝育情况、生活环境、主人是否在场及采集介质等条件具有显著性差异。唾液Cor浓度在猪的福利研究中也被广泛运用，是评估猪应激状况的理想指标[12,43-44]。Morgan等[43]指出了唾液Cor浓度与急性应激程度之间的相关性。近年来，有研究者通过采集分析唾液评估奶牛的应激状况。Riek等[45]研究奶牛血浆Cor浓度与唾液Cor浓度的关系，结果表明，唾液Cor浓度与血浆Cor浓度呈显著正相关，表明奶牛唾液Cor浓度可以很好地指示血浆Cor的浓度，且Cor在唾液中到达峰值浓度的时间比在血液中时间长，表明唾液Cor可能更加适合急性应激的指示。Schwinn等[46]研究唾液Cor作为奶牛生物标记物的可行性，确定了饲料、饮水和反刍对唾液Cor浓度的影响，证明了唾液Cor浓度可间接反映HPA轴的激活程度。Kovacs等[47]通过对急性热应激中奶牛唾液Cor的研究发现，非应激样本和应激样本8：00至12：00唾液Cor浓度分别升高了51%和342%，表明唾液Cor浓度在急性应激过程中急剧上升，与血液Cor浓度变化规律一致，可作为一种急性唾液应激标记物使用。唾液Cor在绵羊中的研究较少。Andanson等[48]对比了唾液采样和血液采样引起绵羊应激的情况，发现唾液采样导致的绵羊Cor浓度的升高显著低于静脉采血，唾液采样过程中不会引起绵羊应激，当唾液样品预期浓度低于55 nmol/L时，建议采用唾液样本进行研究。唾液Cor同样受到生物节律与性别的影响，但与sAA的变化规律不同，唾液Cor的浓度会在醒来后30 min左右到达高峰，而后逐渐下降[49-50]。Choo等[51]研究表明，早上和晚上的唾液Cor浓度相对稳定，能够得到准确的浓度区间。因此，可以经过预试验得到正常的浓度变化区间，从而准确判断唾液Cor浓度区别于生物节律的异常变化。2存在的问题及展望2.1存在问题目前，唾液是一种在人类和动物医学中广泛应用的样品来源。在人类医学中，常指导待测人员将唾液主动吐到洁净无菌聚丙烯管中，直至满足试验用量[13]，或通过咀嚼棉球的方法采集唾液，这种方法更适用于有主动性的人类[52]。在动物医学研究中，也可采用棉签蘸取或咀嚼棉球后离心的方法采集唾液[28,33]。但唾液中的生物活性成分可以从血浆中游离出来，含量较少[53]。且因动物不易受控制，很容易在试验采样过程中造成样品量不足，影响试验进度。McDougall等[4]设计了一种简单的绵羊唾液的收集装置，通过在口腔捆绑一块干海绵来收集唾液，这种轻微的刺激可以通过前期预试验来让试验动物提前适应，尽可能减少额外的应激，但干燥的海绵不易运输和储存，容易受外界的污染和损坏。Fell等[54]改进了海绵收集唾液的设计，将干海绵改成了一节软质塑料软管，管下连有一个盛有干燥棉球的容器，通过咀嚼软管使唾液经软管进入容器，被干燥棉球吸收，取出吸满唾液的棉球离心获得所需唾液样品。这种方法虽解决了海绵容易污染样品的问题，但操作并不方便，在佩戴这种装置时也比较费力。而且这种设备功能单一，只能采得唾液样品，不能测得唾液流量。Leicht等[55]研究表明，唾液Cor浓度与唾液流量呈显著负相关，表明动物在受应激源刺激时，唾液流量会受肾上腺Cor浓度的影响。Storm等[56]建立了一种依靠颈动脉和颈静脉血液中的血红蛋白浓度差换算唾液流量的试验方法，这种方法虽然能够相对准确的换算出唾液流量，但需要在被测对象颈部开口并预留针头及瘘管，家畜会具有极高的感染风险，并且这种入侵式采集会对动物造成很大的伤害，使动物福利降低。随着科技的发展，电子可穿戴设备的使用较多。马瑞芹等[57]建立了一种依靠可穿戴监测设监控肉羊运输应激的模型，可以通过这套穿戴设备实时测定绵羊的体温和心率，判断绵羊运输时受到的应激程度。这为今后采样设备的进一步改进提供了新的思路，即通过不会对家畜产生伤害的各种传感器组成一套完整的应激指标测定系统，在体表测得各个数据，对家畜的生理状况进行实时监控。目前也出现了很多柔性传感器，能够进一步降低设备重量，增加动物的舒适性[58]，基本不会对家畜造成应激。2.2未来研究方向未来关于唾液的研究可以深入至分子基因领域，进一步探索能否通过唾液样品测定其他常用蛋白表达量，以期在动物福利相关研究中用唾液样品完全替代血液样品。Escribano等[59]利用高分辨定量蛋白质组学技术鉴定了绵羊唾液中可能存在的应激生物标记物，发现在应激状态下检测到13种在绵羊唾液中未见报道的蛋白质变化，通过比较确定绵羊唾液中的乳铁蛋白可以作为一种新的应激生物标记物。表明可能在唾液中检出一些常用于判断应激的其他细胞因子，但仍需要进一步验证。3结论唾液是一种很好的非入侵式试验样品，在动物福利的相关研究中可以尽可能改善采样操作对动物造成的不良影响。随着对唾液基因组学的研究，唾液样品的试验应用价值也在不断提升。通过唾液可以判断动物体的应激状况、炎性反应，诊断传染性疾病。目前，唾液样本中检测的指标可以替代一部分血液样本中检测的指标，但能否完全替代血液样本还需要进一步探索，还需要进一步完善采样方法和设备。