猪流行性腹泻病毒（PEDV）是目前威胁养猪业的主要肠道病原体之一[1]，主要表现为新生仔猪尤其是7日龄以内仔猪腹泻、呕吐和脱水等胃肠道症状，具有高致病率及高死亡率[2]。因PEDV不断变异，目前尚无防控效果较好的疫苗及治疗PEDV感染猪群的有效药物，主要通过对症治疗缓解症状，因此，PEDV使养猪业的经济效益降低[3]。槲皮素属于多酚黄酮醇类化合物，具有多种营养生理功能，在畜禽无抗养殖中具有较高的研究和应用价值[4]。槲皮素对多种病毒均具有抗病毒活性[5-6]。研究发现，槲皮素在体外试验中可通过结合PEDV 3C样蛋白酶有效降低Vero细胞中PEDV N蛋白的表达[7]，还可能通过诱导胃肠道上皮细胞模型中上皮紧密连接的重塑和屏障完整性而增强肠道功能[8]，在缓解PEDV对感染仔猪肠道的影响方面具有很大的潜力。蛋白质组学技术是一种研究蛋白质表达、蛋白互作及转录后修饰的高通量方法，可同时对上千个蛋白质进行定性和定量分析，其中无标定量具有不需要昂贵的同位素试剂，且不受标签试剂限制的优点[9]。通过高通量的蛋白质组学技术，可分析槲皮素干预后的差异表达蛋白质，从而揭示槲皮素的靶标蛋白质。目前，关于槲皮素对PEDV感染仔猪的影响研究较少。本试验通过Label-free的相对定量蛋白质组学技术，探究槲皮素体内干预PEDV感染幼龄仔猪的作用及机理，为其在仔猪感染PEDV的应用中提供参考。1材料与方法1.1试验材料PEDV YN毒株（GenBank登录号：KT021228）在Vero细胞上增殖培养，-80 ℃保存；槲皮素购自MCE公司，纯度为98.02%；试验日粮为人工奶粉（商品名：纽瑞兹全脂奶粉），购自纽瑞兹（上海）食品有限公司。奶粉营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T001表1奶粉营养水平项目含量项目参考值/%能量/(kJ/100 g)2 131.0能量25蛋白质/(g/100 g)24.2蛋白质40脂肪/(g/100 g)28.6脂肪48碳水化合物/(g/100 g)38.9碳水化合物13钠/(mg/100 g)264.0钠13钙/(mg/100 g)875.0钙109试验所用7日龄“杜洛克×长白×大白”仔猪，初始体重为（2.6±0.3）kg，购自黄陂某猪场，挑选健康无疾病症状的个体进行试验。1.2试验设计与饲养管理将18头的7日龄“杜洛克×长白×大白”仔猪随机分为3组，每组6个重复，每个重复1头猪。试验期11 d，第0~3 d为预试期；第4~10 d，槲皮素+PEDV组仔猪口腔灌服10 mg/kg BW溶解在人工乳中的槲皮素，对照组和PEDV组仔猪灌服同体积的人工乳；第8 d，PEDV组和槲皮素+PEDV组的仔猪灌服104.5 TCID50的PEDV，对照组仔猪灌服等体积的PBS。试验前将猪舍和猪栏彻底清洗并消毒，猪舍为密闭式，试验期间通风状况良好。对照组仔猪饲养在一间猪舍，PEDV与PEDV+槲皮素组饲养在另一间猪舍。两猪舍的大小、建筑设计及室温条件（22~25 ℃）完全一致。试验期间每日早、晚两次打扫猪舍，使用聚维酮碘消毒液消毒，严格防止两猪舍间发生交叉感染。仔猪每日饲喂5次（7：30、11：00、15：00、18：00、21：00），早晚各喂1次温水。1.3样品采集于试验第11 d，所有仔猪肌肉注射0.15 mL/kg BW舒泰50麻醉，屠宰，取十二指肠、空肠、回肠和结肠中段5 cm，生理盐水冲洗干净肠道内容物后吸去水分，液氮冷冻，转至-80 ℃冰箱保存。1.4肠道蛋白质组检测在T-PER裂解液（赛默飞）中加入12.125%的蛋白酶抑制剂（罗氏）提取肠道样品蛋白质。取200 μg回肠蛋白样品，采用超滤辅助样品制备法（FASP）[10]酶解样品，使用100 μL C18 Tips（赛默飞）脱盐。肽段定量，取1 μg酶解产物，肽段母离子及其二级碎片在Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨率质谱系统上使用高分辨率的Orbitrap进行质谱分析。1.5生物信息学分析二级质谱数据使用Maxquant（v1.5.2.8）进行检索。检索参数设置：数据库为uniprot pig（2021.07.20）；酶切方式设置为Trypsin；可变修饰为甲硫氨酸的氧化（oxidationM），蛋白N端的乙酰化（protein N-term）。定量方法设置为LFQ，LFQ min ratio为2，Match between runs为2 min，Peptide FDR为0.01，Protein FDR为0.01。去除检索结果以“CON_”开头的记录，去除unique peptide小于2的蛋白，剩余蛋白为可信蛋白。差异蛋白的筛选使用perseus（v1.6.2.3）软件筛选，当差异倍数（Fold change）达到1.5倍以上，即可认定为显著差异表达的蛋白（DEP），并将DEPs在Uniprot数据库中进行鉴定。将差异蛋白的信息导入Gene Ontology（http://www.geneontology.org/），在生物进程方向富集分析，在Reactome数据库（http: //www.reactome.org）进行Pathway通路富集分析。1.6肠道病毒基因及功能基因mRNA水平的检测采用Trizol法提取肠道样品中的总RNA，根据PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）试剂盒的方法步骤对RNA进行反转录，合成cDNA；TB Green® Premix Ex Taq™ （Tli RNaseH Plus）试剂盒在荧光定量PCR分析仪上进行实时荧光定量PCR，测定肠道样品的PEDV-N基因和氨基酸代谢与转运功能相关蛋白基因（S）-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶（ABAT）、精氨琥珀酸合酶（ASS1）、鸟氨酸氨基转移酶（OAT）、Y+L氨基酸转运蛋白（y+LAT1）、兴奋性氨基酸转运载体1（EAAC1）、b（0,+）型氨基酸转运蛋白1（b（0,+）AT）、高亲和力阳离子氨基酸转运蛋白1（CAT-1）的相对表达量，采用RPL4基因做内参进行检测，基因的相对表达量计算参照Hou等[11]的方法进行统计。引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T002表2qRT-PCR相关基因上下游引物序列基因引物序列（5'→3'）片段长度/bpRPL4F：GAGAAACCGTCGCCGAAT146R：GCCCACCAGGAGCAAGTTPEDV-NF：CGCAAAGACTGAACCCACTAACTT182R：TTGCCTCTGTTGTTACTCGGGGATASS1F：CCCTCACTTTGCCCATCTCT163R：CCCTACCCTTCCGTTTGCTABATF：GAAGAGAGCCGAGGCAATTA100R：CAGGATGGCTGTAACCTATGGOATF：GCCTCCATCCTCTGATTACATT131R：CGAAGTATCTCCTGCCTTCTACy+LAT1F：TTTGTTATGCGGAACTGG155R：AAAGGTGATGGCAATGACEAAC1F：GGCACCGCACTCTACGAAGCA177R：GCCCACGGCACTTAGCACGAb（0，+）ATF：CGAGTACCCGTACCTGATGGA142R：TGCGTAGAAGGGCGAAGAACAT-1F：TGCCCATACTTCCCGTCC192R：GGTCCAGGTTACCGTCAG试验中所用试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司。1.7数据统计与分析基因的相对表达量结果采用SPSS 17.0统计软件中单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1槲皮素对PEDV感染仔猪肠道PEDV-N基因相对表达量的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，PEDV上调了感染仔猪十二指肠、空肠、回肠、结肠的PEDV-N基因的相对表达量（P0.05）。与PEDV组相比，槲皮素抑制了槲皮素+PEDV组仔猪空肠、回肠PEDV-N基因的相对表达量（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T003表3槲皮素对PEDV感染仔猪肠道PEDV-N基因相对表达量的影响组别十二指肠空肠回肠结肠对照组1.000±0.923b1.000±0.185c1.000±0.122c1.000±0.619bPEDV组102.403±27.391a7 663.178±977.392a17 019.385±3 250.214a65.657±52.963a槲皮素+PEDV组60.159±79.983ab4 323.982±572.404b11 643.709±3 282.592b16.336±8.364ab注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表6与此同。2.2槲皮素对PEDV感染仔猪肠道蛋白质组的影响（见表4~表6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T004表4槲皮素干预PEDV感染后表达回调的蛋白质鉴定结果编号蛋白名称基因名称UniProt登录号差异倍数PEDV组与对照组槲皮素+PEDV组与PEDV组1碱性磷酸酶LOC100522404F1SMT70.279 13.466 92果糖还原酶AKR1E2P821250.118 13.439 33（S）-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶ABATA0A286ZMM30.315 62.744 74氨肽酶ENPEPA0A287AJS40.198 42.587 25胺氧化酶AOC1A0A5S6HCB70.18742.304 86未知蛋白LOC100156325A0A287B9R50.455 32.233 67酰基辅酶A合成酶长链家族成员3ACSL3A0A287A6M30.108 62.214 08脯氨酸脱氢酶PRODHM3V8060.432 61.923 79精氨琥珀酸合酶ASS1A0A287AK650.110 41.889 110葡萄糖神经酰胺酶β3GBA3A0A5G2R7K50.387 91.874 611糖蛋白A33GPA33A0A5G2R8720.298 21.841 912氨甲酰磷酸合酶1CPS1A0A5K1VJQ60.183 01.810 713钠/钾转运ATP酶亚基beta-1ATP1B1P050270.432 91.704 414黏蛋白13MUC13F1SQ580.627 91.689 015果糖二磷酸醛缩酶ALDOBA0A286ZZC90.176 41.688 716半乳糖凝集素LGALS2I3LBA90.486 71.545 817鸟氨酸转氨酶OATF1SDP30.296 81.542 118丝束蛋白PLS1A0A287BI790.270 11.533 919半胱氨酸型内肽酶CASP1I3LIL30.600 31.509 720液泡蛋白VPS13CA0A5G2R6V50.490 21.505 121NAC-A/B结构域蛋白NACAA0A5G2R5U81.991 00.659 822超氧化物歧化酶SOD3A0A286ZNV02.570 10.630 223核质蛋白3NPM3F1S8T71.772 00.620 924蛋白磷酸酶PPM1GA0A5G2Q6Y03.041 30.620 325绒毛蛋白SVILA0A287AXE71.783 60.436 626肌球蛋白轻多肽6MYL6P60662-22.063 00.432 227蛋白磷酸酶1调节亚基PPP1R9BF1RT571.857 70.417 628白细胞介素-16IL-16K7GQ542.176 70.378 929肌球蛋白调节轻链12BMYL12AF1SM7825.636 80.250 130磺基转移酶SULT1A3I3LLX810.112 10.235 631WD重复结构域5WDR5A0A5G2RFW73.348 50.115 2将PEDV组与对照组以及槲皮素+PEDV组与PEDV组差异表达蛋白进行比对，PEDV感染导致仔猪回肠组织中表达上调的蛋白质有190个，其中经过槲皮素处理后有11个差异表达蛋白被回调；PEDV感染仔猪表达下调的蛋白有322个，其中经过槲皮素处理后有20个差异表达蛋白被回调。槲皮素处理后表达回调的蛋白质在Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）中进行检索进行鉴定。由表5可知，槲皮素干预PEDV感染后参与的生物过程主要与氨基酸的代谢有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T005表5槲皮素干预PEDV感染后表达回调的蛋白质生物过程富集分析通路编号通路名称-logPGO：0009064谷氨酰胺家族氨基酸代谢过程6.196 45GO：0008652细胞氨基酸生物合成过程6.171 91GO：0006520细胞氨基酸代谢过程5.215 36GO：1901605α-氨基酸代谢过程4.453 13GO：1901607α-氨基酸生物合成过程4.437 09GO：0043648二羧酸代谢过程4.039 67GO：0046394羧酸生物合成过程3.968 70GO：0016053有机酸生物合成过程3.955 89GO：0009063细胞氨基酸分解代谢过程3.795 42由表6可知，按照蛋白数≥3，P0.05筛选富集通路，差异蛋白参与的通路主要与氨基酸代谢相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T006表6槲皮素干预PEDV感染后表达回调的蛋白质pathway通路富集通路编号通路名称-logPhsa00250丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢5.218 64hsa00330精氨酸和脯氨酸代谢4.794 40R-HSA-71291氨基酸及其衍生物的代谢2.792 032.3槲皮素对感染PEDV仔猪回肠基因相对表达量的影响（见表7）由表7可知，与对照组相比，PEDV组仔猪肠道ABAT表达显著上调（P0.05），ASS1、OAT、y+LAT1、EAAC1、b（0,+）AT、CAT-1的表达显著下调（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.009.T007表7槲皮素对感染PEDV仔猪回肠基因相对表达量的影响项目ABATASS1OATy+LAT1EAAC1b（0，+）ATCAT-1P值0.0020.0010.0010.0010.0010.0010.001对照组1.000±0.238c1.000±0.292a1.000±0.186a1.000±0.202a1.000±0.230a1.000±0.238a1.000±0.259aPEDV组1.308±0.135b0.306±0.088c0.138±0.031c0.250±0.068c0.247±0.069c0.352±0.055c0.294±0.056c槲皮素+PEDV组1.785±0.372a0.570±0.166b0.258±0.045b0.535±0.169b0.520±0.064b0.595±0.080b0.649±0.151b与PEDV组相比，槲皮素+PEDV组仔猪ABAT、ASS1、OAT、y+LAT1、EAAC1、b（0,+）AT、CAT-1的表达显著上调（P0.05）。3讨论3.1槲皮素对感染仔猪肠道病毒基因相对表达量的影响槲皮素广泛存在于各种植物中，如洋葱、番茄、莴苣等[12]。槲皮素在体外具有良好的抗PEDV作用，可通过抑制在病毒水解过程中起重要作用的3C样蛋白酶，从而抑制多种毒株在Vero细胞中的增殖[7]。PEDV的N蛋白在不同的PEDV菌株之间高度保守。因此，PEDV N基因可作为早期PEDV感染准确的诊断靶标[13]。本试验发现，槲皮素可降低PEDV感染仔猪空肠和回肠内的PEDV-N蛋白的相对表达量，表明槲皮素可抑制PEDV在感染仔猪肠道内的增殖，但其在体内试验中干预PEDV感染幼龄仔猪的机制尚不清楚。3.2槲皮素对感染PEDV仔猪肠道氨基酸代谢的影响氨基酸是肠道合成蛋白质、多胺、一氧化氮、ATP的首选营养素，是基因表达和蛋白质磷酸化级联的调节剂。因此，氨基酸代谢对机体免疫功能具有重要作用[14]。Zhang等[15]研究发现，PEDV感染改变了仔猪血浆和空肠中的氨基酸谱，降低了碱性氨基酸的浓度。Zhang等[16]在PEDV感染仔猪肠道蛋白组研究中，发现富集蛋白最多的通路为氨基酸及衍生物代谢通路。本试验中，口腔灌服槲皮素后的差异表达蛋白质生物过程富集分析与通路富集集中于包括精氨酸、谷氨酸和脯氨酸等多种氨基酸代谢有关的通路中；蛋白组学定量结果显示，PEDV感染使仔猪肠道氨基酸代谢相关蛋白表达下调，口腔灌服槲皮素则可缓解这种趋势。由此推测，槲皮素可能通过调节氨基酸代谢途径影响受PEDV感染的仔猪。氨基酸代谢途径与病毒感染的联系可能与氨基酸本身的生理功能有关。研究表明，谷氨酰胺可以促进T淋巴细胞与B淋巴细胞的分化和巨噬细胞产生NO等，其代谢通路可能是潜在的抗病毒靶点[17]。有研究发现，某些具有调节精氨酸相关代谢途径的药物可抑制单纯疱疹病毒的复制[18]。实时荧光定量PCR结果显示，在这些差异表达蛋白中，槲皮素可使氨基酸代谢相关蛋白ASS1、ABAT、OAT基因mRNA水平显著上调。ASS1可催化瓜氨酸与天冬氨酸反应生成精氨酸代琥珀酸[19]，是细胞利用瓜氨酸合成精氨酸的关键限速酶之一[20]。在断奶仔猪的日粮中补充精氨酸可有效提高小肠的绒毛高度，改善肠道功能[21]，并且可通过增加白细胞数目和嗜异细胞数目等免疫指标提高动物机体的免疫功能[22]；ABAT可催化γ-氨基丁酸和α-酮戊二酸反应生成琥珀酸半醛（GSA）和谷氨酸，而谷氨酸可改善猪小肠上皮细胞的屏障和抗氧化功能[23]。任效瑞[24]研究发现，谷氨酸还具有增加肠道上皮间淋巴细胞数、增强免疫功能的作用。鸟氨酸氨基转移酶（OAT）是一种几乎存在于所有真核生物中的酶，可催化鸟氨酸向谷氨酸或脯氨酸的转化[25]。脯氨酸是新生仔猪肠细胞生成精氨酸的主要前体物质，具有防止淋巴细胞凋亡、刺激细胞生长和促进抗体产生等的增强免疫功能的作用[26]。因此，可以推测槲皮素可能通过调节氨基酸代谢从而影响仔猪肠道功能和免疫能力，抑制PEDV感染仔猪，但槲皮素能否提高肠道功能性氨基酸的含量还需进一步研究。3.3槲皮素对感染PEDV仔猪肠道氨基酸转运的影响碱性氨基酸（赖氨酸和精氨酸等）转运系统可分为y+、B（0，+）、b（0，+）、y+L等4种[27]，而兴奋性氨基酸转运载体（EAAC1）是肠道内酸性氨基酸的主要载体[28]。氨基酸无法自由通过细胞膜，需要通过转运体运输至细胞。因此，肠道中氨基酸的代谢与吸收和转运密切相关。PEDV感染导致y+LAT1、EAAC1、b（0,+）AT、CAT-1基因表达下调，表明PEDV感染降低了仔猪肠道对氨基酸的吸收能力。肠道营养转运载体的表达及之后的吸收功能可能会因PEDV感染而显著改变，包括水和离子运输、营养（葡萄糖、脂质和氨基酸）吸收、代谢和运输等[14]。而灌服槲皮素后y+LAT1、EAAC1、b（0,+）AT、CAT-1基因的表达上调，表明PEDV感染仔猪的肠道功能有所改善。上调y+LAT1的表达水平会影响mTOR信号通路的传导，从而导致机体蛋白合成水平的升高[29]。姚佳颖等[30]研究表明，槲皮素可提高氨基酸转运载体相关基因的表达，促进猪肠上皮细胞对蛋白质的利用。因此，槲皮素可缓解PEDV感染导致的肠道对氨基酸吸收能力的下降，促进肠道吸收和转运氨基酸。4结论本研究发现，口腔灌服10 mg/kg·BW的槲皮素可抑制感染PEDV仔猪肠道的病毒相对表达量，可能通过调控氨基酸及其衍生物的代谢通路发挥作用。