中草药饲料添加剂具有清除氧自由基、抗炎及促进生长等功效，在畜禽健康养殖等方面具有重要作用[1-3]。苦木（Picrasma quassioides）是苦木科苦树属植物[4]。《中国兽药典》（2015）记载苦木具有清热、祛湿、解毒功效，可用于畜禽风热感冒、腹泻下痢等疾病的治疗[5]。研究表明，在肉牛饲粮中添加苦木，能够防止酸中毒，减少干物质消耗，提高饲料利用率，且效果优于对照组莫能霉素[6]。在仔猪断奶饲粮中添加苦木，仔猪的平均日增重、腹泻率均比土霉素钙和维吉尼亚霉素的对照组效果更好[7]。苦木汤剂能够改善保育猪生长性能，预防保育猪腹泻[8]，具有改善动物消化性能、提高动物免疫能力等作用[9]。兽医临床上，将苦木制成粉末剂、汤剂、注射剂对猪和牛的溃疡清创、伤风感冒、胃肠炎、白痢等具有较好的治疗效果，尤其对采用抗生素治疗效果不佳，反复发作的无名高热症，治疗效果更好[10-12]。苦木药用部位的记载和实际应用较为复杂，如《中国兽药典》[5]和《中国药典》[13]规定苦木枝、叶入药；《中药大辞典》[14]记载苦木的叶、枝、茎干、根均可入药，且不同部位用量标准不一。苦木不同部位主治不同，《中国民族药志要》[15]记载苦木根和叶的主治功能存在差异。氧化应激会严重影响动物健康，造成种畜繁殖障碍、发病率增加、畜产品品质下降和死亡率提高等[16]。因此，研究苦木提取物的抗氧化活性对其在动物生产中的应用具有重要意义。本研究以苦木的根、茎、枝、叶4个药用部位为材料，比较不同药用部位的抗氧化活性，评估苦木在畜禽养殖中抗氧化应激的潜力，为苦木不同药用部位的合理使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料苦木的根、茎、枝、叶于2020年9月份采自广西河池市东兰县隘洞镇石山区域，不同部位均来自同一植株，经广西药用植物园彭玉德高级工程师鉴定为苦木科苦树属植物苦木。通过年轮分析推测树龄约为16年，根和茎均有少量心材，采后在室内阴干至含水量8.5%左右，密封，冷藏。1.2仪器和试剂101-1B电热恒温鼓风干燥箱（绍兴市易诚仪器制造有限公司）；数显恒温水浴锅（金坛区西城新瑞仪器厂）；TDL-80-2B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；PH-25型PH计（上海越平科学仪器有限公司）；UV-5100B紫外分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司）；SHB-Ш循环水多用真空泵（郑州长城科技工贸有限公司）；RZ01C旋转蒸发器（郑州长城科技工贸有限公司）。2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均购自上海蓝季生物；其他化学试剂均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司。1.3测定指标及方法1.3.1苦木不同药用部位试药制备将苦木（根、茎、枝、叶）干燥，粉碎，过4号筛。取100 g药材粉末，按料液比1∶10 g/mL分3次进行回流提取，加入500 mL 80%的乙醇溶液，回流提取1.5 h，过滤，滤渣加入250 mL 80%乙醇溶液提取1 h，过滤，再加入250 mL 80%的乙醇溶液提取0.5 h，合并3次滤液，减压浓缩为浸膏，干燥得到提取物进行体外药效学试验。1.3.2苦木不同药用部位对ABTS自由基清除能力测定试验方法参考文献[17]，根据预试验结果略有修改。称取苦木不同入药部位干燥品适量，使用50%乙醇溶液配制质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的供试品溶液；同样方法配制0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 g/L的VC溶液。将7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合，室温避光放置12 h，得ABTS母液，母液使用纯化水稀释45倍，得ABTS工作液；精密量取ABTS工作液2 mL置于5 mL试管中，加入1 mL供试品溶液，摇匀，室温避光反应30 min，测定734 nm吸光度，每组3次重复。以纯水做空白对照组吸光度为A0，供试品溶液吸光度为Ai，计算供试品溶液对ABTS自由基的清除率，通过SPSS统计分析得到IC50值。ABTS自由基清除率＝(A0－Ai)/A0×100%(1)1.3.3苦木不同药用部位对DPPH自由基清除能力测定试验方法参照文献[17]进行，在预试验后略有调整。取苦木不同药用部位干燥品适量，以50%乙醇溶液作为溶剂，分别配制质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L的供试品溶液；同法配制0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 g/L的VC对照品溶液。取2 mL浓度为0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液于10 mL试管中，加2 mL供试品溶液，摇匀，室温避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值。供试品溶液吸光度为Ai，纯化水空白对照组吸光度为A0，无水乙醇代替DPPH乙醇溶液组的吸光度为Aj。计算不同供试品溶液对DPPH自由基的清除率，通过SPSS统计分析得到IC50值。DPPH自由基清除率＝[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%(2)1.3.4苦木不同药用部位对铁还原能力的测定参照文献[17]方法进行试验，在预试验后略有调整。取苦木不同药用部位干燥品以50%乙醇溶液配制成质量浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L供试品溶液；使用50%乙醇溶液配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L VC做阳性对照。取2.5 mL供试品溶液加入10 mL试管中，依次加入0.2 mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH值6.6）和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，充分摇匀，于50 ℃水浴锅中反应20 min，冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，充分摇匀，3 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液，加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液及1 mL纯化水，充分摇匀，室温静置10 min，700 nm处测定吸光度。供试品溶液吸光度记为Ai，纯化水空白对照组吸光度为A0。计算不同浓度样品溶液的铁还原能力，通过SPSS统计分析得到半数还原能力A0.5值。铁还原力＝Ai-A0 (3)2结果与分析2.1苦木不同药用部位对ABTS自由基清除能力的影响（见图1）由图1可知，4个部位均具有清除ABTS自由基的能力，且各部位均存在量效关系，药效随药物浓度的升高而增强。当提取物的质量浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L时，叶的清除率分别为51.698%、75.774%、96.028%、97.887%和98.852%，茎的清除率分别为49.887%、66.018%、79.283%、97.057%和98.113%，根的清除率分别为47.245%、61.057%、76.008%、83.925%和87.623%，枝的清除率分别为16.642%、26.491%、42.792%、53.359%和74.113%。图1苦木不同药用部位对ABTS自由基的清除能力注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.015.F1a1（a）苦木不同药用部位ABTS自由基清除率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.015.F1a2（b）苦木不同药用部位ABTS自由基的IC50值在浓度为0.06 g/L时，叶、茎、根、枝的清除率分别为96.028%、79.283%、76.008%和42.792%，此浓度下叶清除率明显高于其他3个药用部位。在浓度为1.0 g/L时，叶、茎、根、枝的清除率分别达到98.852%、98.113%、87.623%和74.113%，分别是VC最高浓度时药效的99.5%、98.7%、88.2%和74.6%。研究表明，苦木各药用部位对ABTS自由基的清除率均较强，叶的清除能力最强。IC50值与药效成反比，IC50值越低自由基清除效率越好，本试验中，苦木叶、茎、根、枝和Vc的IC50值分别为0.003、0.016、0.019、0.070和0.004 g/L，其中叶的IC50值显著高于VC值，表明叶的自由基清除能力强于对照组VC；苦木不同药用部位和阳性对照的ABTS自由基清除能力排序为：叶VC茎根枝。2.2苦木不同药用部位对DPPH自由基清除能力的影响（见图2）由图2可知，不同入药部位的药效随药物浓度的升高而增强，同一浓度时，叶的药效强于其他部位，当药物浓度为0.1 g/L时，叶的DPPH自由基清除率为80.453%，是VC最高浓度时清除率的88.4%，该浓度下根、茎、枝的DPPH自由基清除率分别为VC最高浓度时清除率的51.4%、49.8%、42.4%。研究表明，当给药浓度较高时，叶的DPPH自由基清除率与VC相近，清除率较强，而其他部位的清除率较低。当药物浓度为0.04 g/L时，叶的清除率为61.152%，此清除率高于其他3个药用部位的最高试药浓度0.1 g/L时的清除率。苦木叶、茎、根、枝和VC的IC50值分别为0.041、0.110、0.114、0.133和0.008 g/L，除茎与根无显著差异外，其余部位间差异显著；苦木4个不同药用部位中叶对DPPH自由基的清除效果最好，茎与根效果相当。苦木不同药用部位和阳性对照对DPPH自由基清除能力：VC叶茎根枝。图2苦木不同药用部位对DPPH自由基的清除能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.015.F2a1（a）苦木不同药用部位DPPH自由基清除率10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.015.F2a2（b）苦木不同药用部位DPPH自由基的IC50值2.3苦木不同药用部位铁还原能力比较（见图3）由图3可知，苦木各部位均表现为药效随药物浓度增加而增加，最低试药浓度1 g/L 时叶的铁还原能力为0.816，高于其他根、茎和枝3个药用部位最高试药浓度5 g/L时取得的铁还原能力数值0.629、0.605和0.506；当试药浓度为2 g/L时，叶的提取物对铁的还原力达1.316，是同一浓度时根0.265、茎0.213和枝0.184铁还原能力的5.0、6.2、7.1倍，是最高试药浓度5 g/L时根0.628、茎0.606和枝0.605铁还原能力的2倍以上。当试药浓度分别为1、2、3、4、5 g/L时，叶对铁的还原能力依次增强，各浓度对应铁还原能力为0.816、1.316、1.754、2.057、2.206，分别是对照组VC最高浓度时铁还原能力2.261的36.1%、58.2%、77.6%、91.0%、97.6%；表明苦木叶提取物高浓度给药时还原能力强，对铁的还原能力与VC相近。图3苦木不同药用部位的铁还原能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.015.F3a1（a）苦木不同药用部位的铁还原力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.015.F3a2（b）苦木不同药用部位的A0.5值根、茎、枝、叶及VC的A0.5值依次为3.954、4.036、5.159、0.208和0.049，根和茎间差异不显著；从根、茎的折线图重合较多且趋势较一致，且A0.5值相差不大，表明根与茎的铁还原能力相当。苦木不同药用部位和阳性对照的铁还原能力排序为：VC叶根茎枝。3讨论本研究中，苦木不同部位对ABTS和DPPH自由基清除的活性表现一致，均为叶茎根枝；尤其在ABTS法抗氧化评价中，叶的自由基清除活性显著高于对照组VC，呈现极强的抗氧化能力；在4个药用部位的铁还原能力测定中，叶活性最强，根与茎的铁还原能力弱于叶且二者活性相当（根茎），枝最弱；苦木叶部位的2种氧自由基清除能力以及铁还原能力均在较低的给药浓度时取得较好的效果，常优于其他3个药用部位在较高给药浓度时的清除率和铁还原能力。在4个不同药用部位对ABTS自由基的清除能力试验中发现，当试药浓度为0.06 g/L时，叶的清除率为96.028%，此清除率高于茎在同一试药浓度时的清除率79.283%，高于根和枝在试药浓度为0.1 g/L时的清除率87.623%和74.113%；对DPPH自由基的清除作用和铁还原能力试验中，当药物浓度为0.04 g/L时，叶对DPPH自由基的清除率高于其他3个药用部位最高试药浓度0.1 g/L时的清除率；而在当试药浓度为2 g/L时，叶对铁的还原力1.316是最高试药浓度5 g/L时，根0.628、茎0.606和枝0.605铁还原能力的2倍以上。本试验结果符合《中国药典》记载苦木枝用量3.0~4.5 g，叶用量1~3 g的标准要求[13]。《广东省中药材标准》[18]和《湖南省中药材标准》[19]中记载苦木茎枝用量为3~4.5 g，叶用量1~3 g，均有其药效学层面的合理性。《广东中药志》记载苦木以茎或带叶树枝入药[20]。根据本试验中苦木叶的抗氧化活性判断，苦木的枝、叶应不予区分混合入药的情况；而《中国兽药典》[5]中仅规定“马、牛苦木用量为20~40 g；羊、猪苦木用量为15~30 g；兔、禽苦木用量为2~5 g”，没有对苦木枝、叶进行不同用量设置，其合理性需要进一步研究证实；在苦木作为饲料添加剂使用时，应该针对不同药用部位进行不同的用量比较试验研究，以达到合理利用的目标。《中华本草》[21]和《中药大辞典》[14]记载苦木根、茎入煎剂用量相同。本研究发现，根与茎效果较为相近的结论。因此，苦木药用部位在实际使用中较为复杂，基于本研究中根与茎的体外抗氧化能力相当且明显较枝为优的情况，可考虑增设苦木根为合法药用部位，根茎混用有一定合理性，根、茎入药与枝在用量方面应该有所差异，其具体用量标准设置尚需进一步研究。4结论苦木茎对DPPH、ABTS自由基清除能力优于根，根与茎对铁离子的还原能力相当，苦木枝的抗氧化活性最弱。苦木不同入药部位的体外抗氧化活性存在差异，均可以作为动物生产的抗氧化应激剂使用，可为苦木资源在畜牧业的开发利用及新型饲料添加剂的研究提供参考。