菌糠是培养基剩余物，源于食用菌代料栽培收获。研究表明，食用菌菌糠中富含菌体蛋白、氨基酸、多糖、纤维素、木质素等有机质以及钙、锌、铁、镁等多种微量元素[1-3]。菌糠中含有粗脂肪0.12%~6.00%、粗蛋白9%~13%、粗纤维10%~30%[1]。我国每年每次生产的菌糠量达1.17~1.80亿t[4-5]。目前食用菌菌糠的处理方法主要为随意丢弃或焚烧，只有少部分直接作为有机肥、栽培基质[6-7]、饲料[8-9]、生物质能源[10-12]、生态修复材料[13-14]或食用菌的二次栽培[15-16]等，这些剩余的食用菌糠很容易造成环境污染和资源浪费。低聚木糖是指由2~7个木糖分子以β（1-4）糖苷键连接而成的木寡糖[7]，其主要通过酸水解法、热水抽提法、酶解法、微波降解法进行制备[17-19]。低聚木糖具有酸、热稳定性好等性能，是一种可在最小使用量就可选择性增殖双歧杆菌的低聚糖[20]，能够有效调整肠道菌群和保证肠道健康[21]，增强机体免疫力，抗肿瘤，预防龋齿[22-23]，降糖降脂[24]，有利于钙的吸收[25]，调节脂质代谢[21]。菌糠中含有较多的纤维素，直接作为饲料原料存在适口性差、消化吸收利用率低等问题。采用生物酶解法生产含低聚木糖的菌糠饲料，可以合理利用菌糠资源，减少环境污染，提高食用菌生产企业的经济效益，促进食用菌工厂化栽培的良性发展。本研究以杏鲍菇菌糠为研究材料，通过预处理与生物酶酶解法，研究制备含低聚木糖杏鲍菇菌糠饲料的工艺参数，以期为食用菌菌糠的资源化循环利用和规模化处理提供参考。1材料与方法1.1试验材料杏鲍菇菌糠由湖南宇秀生物科技有限公司提供，无霉变和虫蛀，粉碎至40~60目。1.2主要试剂过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司；碳酸钠购自湖南试剂厂；纤维素酶（10 000 U/g）、木聚糖酶（100 000 U/g）、甘露聚糖酶（8 000 U/g）均购自湖南利尔康生物股份有限公司；色谱纯乙腈购自德国Merck公司；高纯氮购自长沙长钢气体有限公司。1.3主要仪器设备himac CR 21G高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）、AR224CN电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）、日本Nacalai Tesque COSMOSIL Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、高效液相色谱仪（Agilent 1260）；蒸发光散色检测器（ELSD）、电热恒温水浴锅（TW12，JULABO）、DHG-9076A立式恒温鼓风干燥箱（上海精宏仪器有限公司）。1.4测定指标及方法1.4.1杏鲍菇菌糠预处理条件筛选准确称取10.00 g粉碎至40~60目的杏鲍菇菌糠粉于200 mL烧杯中，调节液料比为2 mL/g，加入6% H2O2、1% Na2CO3，搅拌均匀，于50 ℃恒温条件下预处理3 h，冷却。将预处理后的菌糠使用稀酸调节pH值5.0，按菌糠干重加入200 U/g的木聚糖酶，50 ℃恒温酶解3 h，60 ℃烘干至恒重，测定酶解物中低聚木糖的含量。1.4.2单因素试验1.4.2.1菌糠预处理温度对低聚木糖产量的影响将杏鲍菇菌糠分别置于40、50、60、70和80 ℃条件下，其他条件不变，考察预处理温度对低聚木糖产量的影响。1.4.2.2H2O2和Na2CO3质量分数比对低聚木糖产量的影响按菌糠质量在菌糠中加入质量分数比分别为1%∶6%、2%∶5%、3%∶4%、4%∶3%、5%∶2%、6%∶1%的H2O2和Na2CO3。其他条件不变，考察不同H2O2和Na2CO3质量分数比对低聚木糖产量的影响。1.4.2.3液料比对低聚木糖产量的影响调节菌糠的液料比为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，其他条件不变，考察液料比对低聚木糖产量的影响。1.4.2.4预处理时间对低聚木糖产量的影响将杏鲍菇菌糠分别预处理1、2、3、4和5 h，其他条件不变，考察不同预处理时间对低聚木糖产量的影响。1.4.3酶解条件的研究1.4.3.1酶种类对低聚木糖产量的影响预处理后的杏鲍菇菌糠中按底物干重分别加入200 U/g的木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶以及木聚糖酶∶纤维素酶、木聚糖酶∶甘露聚糖酶、纤维素酶∶甘露聚糖酶、木聚糖酶∶纤维素酶∶甘露聚糖酶。按液料比4 mL/g加入蒸馏水，搅拌均匀，使用稀酸或者稀碱调节pH值至6.0，50 ℃条件下恒温酶解3 h，60 ℃烘干至恒重，测定低聚木糖的产量。1.4.3.2混合酶添加量对低聚木糖产量的影响在预处理后的杏鲍菇菌糠中按底物干重分别加入200、300、400、500和600 U/g混合酶（混合酶由酶活由木聚糖酶∶纤维素酶∶甘露聚糖酶比例1∶1∶1组成），50 ℃条件下酶解3 h，60 ℃烘干至恒重，测定低聚木糖的产量。1.4.3.3酶解液料比对低聚木糖产量的影响分别调节预处理后的杏鲍菇菌糠的液料比3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL/g，其他条件相同，50 ℃条件下酶解3 h，60 ℃烘干至恒重，测定低聚木糖的含量。1.4.3.4酶解温度对低聚木糖产量的影响将经过预处理的杏鲍菇菌糠调节液料比和加入混合酶后，分别于35、40、45、50、55、60 ℃条件下酶解3 h，60 ℃烘干至恒重，测定低聚木糖的含量。1.4.3.5pH值对低聚木糖产量的影响将经过预处理的杏鲍菇菌糠用稀酸或稀碱调节pH值为3、4、5、6、7，其他条件相同，45 ℃条件下酶解3 h，60 ℃烘干至恒重，测定低聚木糖的含量。1.4.3.6酶解时间对低聚木糖产量的影响根据上述得到的试验结果，对经过预处理的杏鲍菇菌糠，分别酶解1、2、3、4、5 h，60 ℃烘干至恒重，测定低聚木糖含量。1.4.4酶解条件正交试验优化设计根据单因素试验结果，选择酶解温度（A）、酶解pH值（B）、液料比（C）、混合酶添加量（D），进行正交试验。L9(34)正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平A/℃BC/(mL/g)D/(U/g)14544.030025054.540035565.05001.4.5杏鲍菇菌糠中低聚木糖含量准确称取5.00 g经酶解并干燥后的杏鲍菇菌糠于100 mL蒸馏水中，30 ℃、120 r/min提取30 min，离心，收集离心液；残渣重新加入100 mL蒸馏水，按上述方法提取，合并离心液，定容至200 mL，获得粗低聚木糖液。参照文献[26]方法测定杏鲍菇菌糠中低聚木糖含量。2结果与分析2.1杏鲍菇菌糠预处理结果2.1.1温度对低聚木糖产量的影响（见图1）由图1可知，在预处理温度40~50 ℃范围内，低聚木糖产量随预处理温度的升高而升高。当预处理温度为50 ℃时，低聚木糖产量最高，为56.96 mg/g，预处理温度超过50 ℃，低聚木糖产量显著降低。因此，选择预处理温度为50 ℃进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F001图1温度对低聚木糖产量的影响2.1.2H2O2与Na2CO3质量分数比对低聚木糖产量的影响（见图2）由图2可知，在一定范围内，随着预处理H2O2与Na2CO3质量分数比的增加低聚木糖产量增加。当H2O2与Na2CO3添加量分别为3%、4%时，低聚木糖产量达到61.99 mg/g。因此，选择H2O2与Na2CO3添加量分别为3%、4%进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F002图2H2O2与Na2CO3质量分数比对低聚木糖产量的影响2.1.3液料比对低聚木糖产量的影响（见图3）由图3可知，当液料比为2.5 mL/g时，低聚木糖产量达67.64 mg/g，液料比超过2.5 mL/g时，低聚木糖产量下降。因此，选择预处理液料比2.5 mL/g进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F003图3液料比对低聚木糖产量的影响2.1.4预处理时间对低聚木糖产量的影响（见图4）从图4可知，当预处理时间为5 h时，低聚木糖产量最高，达67.37 mg/g，但与预处理3 h的低聚木糖产量差异不显著。因此，选择适宜的预处理时间为3 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F004图4预处理时间对低聚木糖产量的影响2.2酶解条件研究结果2.2.1酶种类对低聚木糖产量的影响（见图5）从图5可知，不同种类的酶及组成的混合酶，对预处理后的杏鲍菇菌糠酶解产低聚木糖产量的影响较大。当以木聚糖酶、纤维素酶，甘露聚糖酶组成的混合酶酶解杏鲍菇菌糠时，低聚木糖产量可达到78.63 mg/g。因此，以木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶组成的混合酶进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F005图5酶种类对低聚木糖产量的影响注：1为木聚糖酶，2为纤维素酶，3为甘露聚糖酶，4为木聚糖酶+纤维素酶，5为木聚糖酶+甘露聚糖酶，6为纤维素酶+甘露聚糖酶，7为木聚糖酶+纤维素酶+甘露聚糖酶。2.2.2混合酶添加量对低聚木糖产量的影响（见图6）由图6可知，低聚木糖产量随着混合酶添加量的增加而提高。当混合酶添加量为400 U/g时，低聚木糖产量达84.78 mg/g，但混合酶添加量超过400 U/g，低聚木糖产量虽略有增加，但差异不显著。因此，综合生产成本考虑，选择混合酶添加量为400 U/g进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F006图6混合酶添加量对低聚木糖产量的影响2.2.3酶解液料比对低聚木糖产量的影响（见图7）由图7可知，在液料比为3.0~4.5 mL/g内，低聚木糖产量随液料比增加而提高。当酶解液料比达4.5 mL/g时，低聚木糖产量最高，为88.72 mg/g，但培养基中水分含量增加，低聚木糖产量显著下降。因此，选择酶解液料比为4.5 mL/g进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F007图7液料比对低聚木糖产量的影响2.2.4酶解温度对低聚木糖产量的影响（见图8）由图8可知，在适宜的酶解温度范围内，随着酶解温度的增加，低聚木糖产量也会随之提高，当酶解温度到达45 ℃时，低聚木糖产量可达到91.23 mg/g，但低聚木糖产量在酶解温度超过45 ℃时缓慢下降。因此，选择酶解温度45 ℃进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F008图8酶解温度对低聚木糖产量的影响2.2.5酶解pH值对低聚木糖产量的影响（见图9）由图9可知，在一定范围内，随着酶解pH值的增加，低聚木糖产量增高，当酶解pH值为6.0时，低聚木糖产量达92.52 mg/g，但酶解pH值超过6.0时，低聚木糖产量显著下降。因此，选择酶解pH值6.0进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F009图9酶解pH值对低聚木糖产量的影响2.2.6酶解时间对低聚木糖产量的影响（见图10）由图10可知，当酶解时间为4 h时，低聚木糖产量最大可达93.83 mg/g，但酶解时间超过4 h，低聚木糖产量变化不大或略微下降。原因可能是杏鲍菇菌糠中的半纤维素全部被降解或低聚木糖进一步被降解成木糖。因此，选择适宜的酶解时间为4 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.F010图10酶解时间对低聚木糖产量的影响2.3酶解条件正交试验结果（见表2、表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.T002表2正交试验结果项目ABCD低聚木糖产量/(mg/g)1111142.392122247.753133363.234212357.015223152.906231297.677313237.998321359.949332170.86K1153.37137.39200.00166.15K2207.58160.54175.62183.41K3168.79231.76154.12180.18k151.1245.8066.6755.38k269.1953.5158.5461.14k356.2377.2551.3760.06R18.0731.4515.305.7610.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.T003表3正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性修正模型7 619.0208953.3785.5820.01**A1 560.3882780.1944.5730.05*B4 836.36922 418.18414.1740.01**C1 053.8702526.9353.0880.05D168.394284.1970.4930.05误差3 071.02318170.612修正后总计10 690.04326注：“**”表示差异极显著（P0.01），“*”表示差异显著（P0.05）。由表2可知，杏鲍菇菌糠预处理后酶解产低聚木糖的适宜组合为A2B3C1D2，即酶解温度50 ℃、酶解pH值6.0、酶解液料比4 mL/g、酶解酶添加量400 U/g，低聚木糖产量为97.67 mg/g。通过极差分析可知，对低聚木糖产量的影响顺序为：BACD。2.4验证试验结果（见表4）通过上述正交试验优化得到的最优组合，进行验证试验，3次重复。由表4可知，在最优组合条件下，通过验证试验得到低聚木糖平均产量为96.46 mg/g，与正交试验得到的产量只相差1.24%，表明通过正交试验得到的最适酶解工艺条件较为稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.014.T004表4验证试验结果项目123平均值低聚木糖产量96.1795.8497.3896.46mg/g3结论试验通过单因素试验确定适宜的预处理工艺条件为：预处理温度50 ℃、H2O2与Na2CO3质量分数比3%∶4%、预处理液料比2.5 mL/g、预处理时间3 h。在此基础上，杏鲍菇菌糠产低聚木糖适宜的酶解工艺为：酶种类由木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶相同酶活力组成的混合酶、混合酶添加量为400 U/g、酶解液料比为4 mL/g、酶解温度为50 ℃、pH值6.0、酶解时间4 h，低聚木糖产量可达到97.67 mg/g。