随着养殖业规模的不断壮大，玉米、豆粕等主要饲料资源供应紧张，因此需要加强对非常规饲料资源的开发利用。我国糟渣类饲料资源产量巨大、种类齐全，其中葡萄皮渣年产可达50万t[1]。由于葡萄皮渣粗纤维含量较高，仅有少量的葡萄皮渣被回收利用，造成了饲料资源的极大浪费。葡萄皮渣通过微生物发酵，能够提高蛋白质含量和粗纤维利用率，改善适口性，是葡萄皮渣综合利用的重要途径[1-5]。关于酵母对葡萄皮渣进行发酵的研究较多[6-8]，酵母菌通过固态发酵后，菌体蛋白含量提高[9]。酵母还可产酶，提高饲料的消化利用率，提高动物采食量[10]。酵母菌与乳酸菌进行混菌发酵，两种菌株可以发挥协同或拮抗作用[11-14]。张丽芝等[15]研究产朊假丝酵母单菌发酵葡萄皮渣，发现发酵葡萄皮渣真蛋白为13.88%，产朊假丝酵母及嗜酸乳杆菌混菌发酵，发酵葡萄皮渣真蛋白为13.75%。翟羽佳等[12]通过正交试验对嗜酸乳杆菌与产朊假丝酵母混合发酵工艺优化，发现葡萄皮渣中真蛋白质含量由10.10%提高至14.45%。目前，关于应用酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵葡萄皮渣的研究未见报道。本研究根据响应面法[16]，以发酵后葡萄皮渣真蛋白含量为指标，对植物乳杆菌与酿酒酵母固态发酵葡萄皮渣的发酵条件进行筛选优化，为进一步开发利用葡萄皮渣提供参考。1材料与方法1.1试验材料酿酒酵母（活菌数3×109 CFU/g）、植物乳杆菌（活菌数5.8×109 CFU/g）由河南牧业经济学院微生物实验室提供。葡萄皮渣购自洛阳唐僧寺酒堡有限公司；玉米、麸皮购自郑州牧康饲料公司。1.2主要仪器设备SW-CJ-2FD超净工作台（成都金凯诺实验设备有限公司）；STFR-47S数显电热恒温干燥箱（上海佳胜实验设备有限公司）；K9840型半自动凯氏定氮仪（济南海能仪器股份有限公司）；T100石墨消解仪（济南海能仪器股份有限公司）；FZ102粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；PHS-3C型pH计（海佑科仪器仪表有限公司）。1.3固体发酵培养1.3.1培养基MRS培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉提取物10.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、乙酸钠5.0 g、酵母浸粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、吐温-80 1.0 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、琼脂15 g、MnSO4·H2O 0.25 g、蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌15 min，用于活化、培养植物乳杆菌。YEPD培养基：酵母粉10.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨20.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌15 min，用于活化、培养酿酒酵母菌。YEPD培养基加20 g琼脂即可配制为固体培养基。1.3.2发酵种子液分别从上述培养基中挑取一环，分别接种于各自液体培养基中，30 ℃培养48 h，在液体培养基中按1%接种后经24 h扩大培养，制备为种子液。1.3.3制备葡萄皮渣发酵培养基烘干粉碎的葡萄皮渣70%、辅料30%（玉米和麸皮各15%）、硫酸铵1.5%、尿素2.0%、磷酸二氢钾1.5%、硫酸镁0.40%，料液比1 g/mL，自然pH值，121 ℃高压灭菌锅灭菌20 min。1.3.4接种发酵按照接种量与接种比例将发酵种子液接种至葡萄皮渣培养基中，30 ℃恒温培养箱中培养，每日翻动2次。1.3.5干燥将发酵葡萄皮渣置于恒温干燥箱中80 ℃烘干至恒重，粉碎，进行样品测定分析。1.4测定指标及方法1.4.1营养成分含量使用硫酸铜沉淀法[17]测定真蛋白含量；直接干燥法测定水分含量（GB 6435—2014）；凯氏定氮法测定粗蛋白质含量（GB 6432—2018）；高温灼烧法测定粗灰分含量（GB 6438—2007）；测定粗纤维含量（GB/T 5009.10—2003）。1.4.2单因素试验在前期预试验基础上，在葡萄皮渣固态培养基中接种酿酒酵母和植物乳杆菌进行混合发酵，研究不同发酵时间、接种比例、接种量、料层厚度、pH值等因素固态发酵对葡萄皮渣中真蛋白含量的影响。1.4.2.1发酵时间将酿酒酵母与植物乳杆菌接入葡萄皮渣培养基中，接种量为10%，接种比例为1∶1，在pH值5.5，基质厚度5 cm，30 ℃条件下，研究发酵48、56、64、72、80 h对发酵基质中真蛋白含量的影响，设3次平行试验[18]。1.4.2.2接种比例将酿酒酵母与植物乳杆菌接入葡萄皮渣培养基中，接种量为10%，在pH值5.5，基质厚度5 cm，30 ℃条件下发酵72 h，研究接种比例1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.5∶1.0、1.0∶2.0、2.0∶1.0对真蛋白含量的影响，设3次平行试验。1.4.2.3接种量将酿酒酵母与植物乳杆菌接入葡萄皮渣培养基中，接种比例为1.0∶1.0，pH值5.5，基质厚度5 cm，温度30 ℃条件下发酵72 h，研究接种量5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%对真蛋白含量的影响，设3次平行试验。1.4.2.4料层厚度将酿酒酵母与植物乳杆菌接入葡萄皮渣培养基中，接种量为10%，接种比例为1.0∶1.0，在pH值5.5，温度30 ℃条件下发酵72 h，研究基质厚度1、2、3、4、5 cm对发酵基质中真蛋白含量的影响，设3次平行试验。1.4.2.5pH值对产物中真蛋白含量的影响将酿酒酵母与植物乳杆菌接入葡萄皮渣培养基中，在接种量为10%，料层厚度为5 cm，接种比例为1.0∶1.0，温度30 ℃条件下发酵72 h，研究pH值4.5、5.0、5.5、6.0、6.5对产物中蛋白质含量的影响，设3次平行试验。1.4.3Plackett-Burman试验设计经过对不同发酵时间、接种比例、接种量、基质厚度、pH值单因素试验结果进行分析，在单因素试验基础上进行PB试验，对5个单因素进行分析，筛选出显著性因素，每个因素取高（+1）、低（-1）2个水平，以真蛋白含量为响应值Y，进行12组试验。Plackett-Burman试验因素及水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T001表1Plackett-Burman试验因素及水平设计水平发酵时间（A）/h接种比例（B）接种量/%（C）料层厚度（D）/cmpH值（E）-1641.0∶1.01035.51802.0∶1.01556.51.4.4响应面试验设计采用Box-Behnken的中心组合设计模型，通过Plackett-Burman试验，筛选出3个重要显著性因素，选取发酵时间（A）、接种比例（B）、pH值（C）3个因素进行响应面优化设计，对酿酒酵母与植物乳杆菌固态发酵葡萄皮渣的发酵工艺进行优化，响应面试验因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T002表2响应面试验因素水平设计水平A/hBC/%-1641.0∶1.05.50721.5∶1.06.01802.0∶1.06.51.5数据统计与分析采用Origin pro 2018软件作图，Design-Expert 12软件对试验结果进行方差分析[16]。2结果与分析2.1葡萄皮渣发酵工艺优化单因素试验结果2.1.1发酵时间对产物中真蛋白含量的影响（见图1）由图1可知，随着发酵时间的延长，发酵基质中真蛋白的含量提高。发酵72 h时，产物中真蛋白含量最高，为14.32%，但随着时间延长真蛋白含量降低。在发酵前期，酵母菌对乳酸菌具有一定的促进作用，而在发酵后期乳酸菌代谢产物抑制酵母菌生长，又表现出一定的拮抗作用[13]。因此，选取发酵时间为72 h进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.F001图1发酵时间对产物中真蛋白含量的影响2.1.2接种比例对产物中真蛋白含量的影响（见图2）由图2可知，发酵基质中真蛋白含量随着酵母菌的接种比例的提高而增加。当酵母菌∶乳酸菌为1.5∶1.0时，基质中真蛋白含量达到最高，为14.35%。因此，酵母菌可以将培养基中营养物质快速变为菌体蛋白，乳酸菌对酵母菌菌落的生长具有促进作用[18]，酵母菌为乳酸菌提供营养因子，乳酸菌为酵母菌提供能量来源。酵母菌和乳酸菌混合培养也具有拮抗作用，如乳酸菌产生的代谢产物苯乳酸、环肽类成分等抑制了酵母菌的增殖[19]。因此，根据接种比例对基质中真蛋白含量变化的结果发现，选择酵母菌与乳酸菌比例为1.5∶1.0进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.F002图2接种比例对产物中真蛋白含量的影响2.1.3接种量对产物中真蛋白含量的影响（见图3）由图3可知，混合发酵菌株接种量为12.5%时，发酵产物中真蛋白含量最高，为14.12%。当接种量过少时，菌体生长缓慢，营养物质不能进行有效利用，发酵周期会相对延长；当接种量为15%时，发酵前期由于菌体快速增殖，会使葡萄皮渣培养基中的营养物质被快速消耗，热量快速释放，导致合成菌体蛋白合成减少。因此，选取混合发酵剂接种量为12.5%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.F003图3接种量对产物中真蛋白含量的影响2.1.4料层厚度对产物中真蛋白含量的影响（见图4）由图4可知，料层厚度为4 cm时，产物的真蛋白含量达到最高，为13.67%。当料层厚度过小时，水分较易散失，菌体生长代谢受限；当料层厚度过大时，培养基透气性不佳，菌体产生的水分及热量不易散失，导致菌体生长代谢受阻。因此随着料层逐渐加厚，发酵产物中真蛋白含量也开始降低。因此，选取料层厚度4 cm为最佳培养基厚度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.F004图4料层厚度对产物中真蛋白含量的影响2.1.5pH值对产物中真蛋白含量的影响由图5可知，当pH值为6.0时产物中真蛋白质含量最高，随着pH值增加，真蛋白含量明显开始下降。pH值与微生物的生命活动密切相关，菌体生长及代谢产物的形成是在各种酶的催化作用下完成，因此pH值通过影响酶的活性从而影响菌体生长及物质的合成。pH值过低时抑制了菌体的生长进而影响菌体蛋白的合成，pH值过高时一些酶类和营养物质可能变性分解，同时合成菌体蛋白的能力降低。因此，选取pH值为6作为培养基的最佳条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.F005图5pH值对产物中真蛋白含量的影响2.2Plackett-Burman试验与方差分析结果（见表3、表4）2.2.1Plackett-Burman试验结果使用Design-Expert 12进行PB设计，选取发酵时间（A）、接种比例（B）、接种量（C）、料层厚度（D）、pH值（E），发酵基质中真蛋白含量（Y），进行Plackett-Burman试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T003表3Plackett-Burman试验结果试验号ABCDEY/%1-1-1-11-114.562-1111114.18311-11113.5941-1-11113.675111-1-113.866-1-11-1114.487-1111-114.12811-1-1-113.5691-11-1113.65101-111-114.6811-1-1-1-1-114.7612-11-1-1113.782.2.2PB试验的方差分析使用Design Expert12软件对所得数据进行分析，由表4可知，当P0.05时，则该因素为显著影响真蛋白的主要因素，且P值越小，影响越显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T004表4PB试验的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型1.83050.3705.580.029 4*A0.69010.69010.460.017 8*B0.61010.6109.320.022 4*C0.09210.0921.400.281 6D0.04210.0420.640.454 3E0.40010.4006.090.048 6*残差0.39060.066总和2.23011注：“*”表示影响显著（P0.05）。根据P值确定对试验指标Y影响，对Y的影响排列为ABECD；对Y值影响显著排列顺序为ABE，其他因素对Y值影响不显著。因此，选择发酵时间（A）、接种比例（B）、pH值（E）3个因素进行3因素3水平的响应面分析试验。2.3响应面优化试验2.3.1响应面试验结果（见表5）2.3.2回归模型的建立及显著性分析利用Design Expert12软件对表5数据进行回归分析，得到预测值Y对自变量A、B、C的二次多项回归方程：Y=15.15+0.064A-0.007 5B+0.064 0C+0.072AB+0.075AC-0.092BC-0.89A2-0.68B2-0.59C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T005表5响应面试验结果试验号A/hBC/%Y/%1721.5∶1.06.015.142801.5∶1.05.513.573641.0∶1.06.013.634721.0∶1.06.513.995721.5∶1.06.015.126801.5∶1.06.513.897641.5∶1.05.513.598721.5∶1.06.015.129722.0∶1.06.513.8510721.5∶1.06.015.1911801.0∶1.06.013.6112721.5∶1.06.015.1813721.0∶1.05.513.7214641.5∶1.06.513.6115722.0∶1.05.513.9516642.0∶1.06.013.4117802.0∶1.06.013.68方差分析结果见表6。由表6可知，模型的P0.0001，表明该模型达到高度显著，相关系数R2=0.998 0，表明回归方程能够较好拟合真蛋白含量变化，真蛋白含量的变化有99.80％来自所选因素；校正决定系数R2adj=0.995 5，表明模型实际值与预测值拟合较好；变异系数（CV）（0.33%）较低，表明试验可信度高。失拟项F值=3.23，P值=0.140 60.05，表明该模型选择正确，可用于酿酒酵母和植物乳杆菌固态发酵葡萄皮渣的工艺研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T006表6方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型7.660 0090.850 000391.520.000 1**A0.033 0010.033 00014.950.006 2**B0.000 4510.000 4500.210.663 0C0.033 0010.033 00014.950.006 2**AB0.021 0010.021 0009.670.017 1*AC0.023 0010.023 00010.340.014 7*BC0.034 0010.034 00015.740.005 4**A23.340 0013.340 0001 533.410.000 1**B21.930 0011.930 000888.580.000 1**C21.490 0011.490 000685.350.000 1**残差0.015 0070.002 175失拟性0.011 0030.003 6083.230.140 6纯误差0.004 4040.001 100总和7.680 0016注：1.“**”表示影响极显著（P0.01），“*”表示影响显著（P0.05）。2.R2=0.998 0，R2adj=0.995 5。2.4验证试验结果根据所得二次多项回归方程，利用响应面软件进行条件优化，得到优化参数为：发酵时间72.3 h、接种比例1.5∶1.0、pH值6.03，此时发酵基质中真蛋白含量的最优预测值为15.15%。因此，采用上述最佳方案进行混菌固态发酵试验，考虑实际操作情况，对酿酒酵母与植物乳杆菌对葡萄皮渣固体发酵的最佳条件修正为发酵时间为72 h，酿酒酵母与植物乳杆菌接种比例为1.5∶1，pH值6.0，经3次平行试验，所得发酵产物中真蛋白含量为15.03%，与预测理论值差异较小，因此该模型可对酿酒酵母与植物乳杆菌混合发酵葡萄皮渣的最优条件进行预测。发酵前后葡萄皮渣培养基中营养成分比较见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.017.T007表7发酵前后葡萄皮渣培养基中营养成分比较项目真蛋白含量粗蛋白水分粗纤维粗灰分发酵前10.4512.799.3722.686.76发酵后15.0330.128.5513.886.77%由表7可知，试验方法具有可行性，并且产物中粗纤维含量大大降低，增加了发酵产物的适口性。3讨论葡萄皮渣中含有蛋白质、氨基酸等多种营养物质[2-3]，还含有大量的多酚类物质，如抗癌物质白藜芦醇及强抗氧化剂原花青素等，具有抗衰老、抗氧化、提高机体抗病力等功能[20-21]。酿酒葡萄皮渣因含有较高纤维素等抗营养因子，不宜直接饲喂动物，主要开发途径是通过固体发酵生产微生物蛋白饲料，进而发挥其营养价值，实现糟渣资源的合理利用[22]。接种酵母菌进行发酵提高葡萄皮渣的蛋白质营养价值的研究较多，林清华等[23]应用正交试验法对葡萄皮渣接种酵母与土曲霉培养基优化，发现葡萄皮渣的粗蛋白含量从13%上升至26.66%。周广麒等[6]利用正交试验研究菌酶协同处理对葡萄皮渣进行发酵，发现发酵产物粗纤维含量降低4.83%。冯昕炜等[7]对酿酒酵母和饲料酵母（接种比例为2.0∶1.0）对葡萄皮渣发酵，发现粗纤维中中性纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量极显著降低，粗蛋白含量极显著提高。朱新强等[24]采用正交试验法对豆渣、苹果渣和葡萄皮渣复配为发酵原料，经过酿酒酵母、乳酸杆菌和纤维素酶发酵处理后，发现发酵原料的粗蛋白含量提高，并产生了蛋白酶等组分。张丽芝等[15]研究葡萄皮渣为发酵基质，对真蛋白含量进行分析，筛选得到产朊假丝酵母与嗜酸乳杆菌双菌组合发酵效果最佳。翟羽佳等[12]采用正交试验法以嗜酸乳杆菌与产朊假丝酵母菌双菌混合对葡萄皮渣发酵，发酵基质中真蛋白含量较发酵前提高了4.35%，含量达14.45%（干基）。因此，采用正交试验法利用微生物发酵葡萄皮废渣生产蛋白饲料，能够提高产物蛋白质含量，降低了粗纤维等抗营养因子，还含有大量活性和非活性有益微生物，能够有效节约资源。本研究利用响应面法对葡萄皮渣进行酿酒酵母和植物乳杆菌的固态发酵蛋白饲料条件优化，确定了酿酒酵母菌和植物乳杆菌固态发酵葡萄皮渣的最佳工艺条件为发酵时间72 h、pH值为6.0、接种比例（酵母菌∶乳酸菌）1.5∶1.0，按照此工艺条件，发酵后葡萄皮渣培养基里所含的真蛋白含量增加至15.03%，与未发酵的葡萄皮渣相比提高了43.83%，与张丽芝[15]、翟羽佳[12]等研究结果基本一致。葡萄皮渣发酵转化为营养价值较高的菌体蛋白，形成含有丰富益生菌、适口性好的发酵饲料，对开发非常规饲料资源具有重要意义。4结论本研究通过响应面法固态发酵葡萄皮渣最优工艺参数为发酵时间72 h、接种比例（酿酒酵母∶植物乳杆菌）1.5∶1.0、pH值6.0，通过模型预测的最大真蛋白含量为15.15%。经过验证试验，真蛋白含量为15.03%。葡萄皮渣通过响应面法筛选优化后，比发酵前葡萄皮渣真蛋白含量（10.45%）提高了43.83%。乳酸菌和酵母菌固态发酵具有协同和抑制等互作效应，酿酒酵母促进蛋白合成，植物乳杆菌具有抑菌和益生特性，进而改善了葡萄皮渣的营养价值，增加了发酵产物的适口性。