金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性的条件致病菌，通常无症状定植于机体的皮肤、鼻腔、黏膜等[1]，可在合适条件下引发人类以及动物发生浅表性和侵袭性感染，如皮肤和软组织感染以及肺炎、关节炎、菌血症和脓毒症[2]。因抗生素的临床应用存在差异，导致药物在人、动物和环境中残留，提高了细菌的耐药率[3]。目前，治疗金黄色葡萄球菌的药物较少，亟须研发新的不易产生耐药以及残留率低的药物[4]。植物精油的毒副作用小、残留率低，有望成为化学合成药物的有效替代品，已经在生物制药、医学、农业、食品等领域广泛应用[5]。山苍子精油（LEO）是从山苍子果实中提取[6]，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉素等具有明显的抑制作用[7]。周鹏等[8]发现，LEO能够作为高效饲料防霉剂。崔惠敏等[9]发现，腹腔注射LEO可降低细菌感染大菱鲆的病死率。江倩茗等[10]研究发现，LEO作为饲料添加剂可刺激动物食欲，提高采食量。丁香精油（CEO）主要是由丁香花蕾提取[11]，已广泛用作抗菌药物或者添加剂等[12]。在饲粮中添加CEO可调节母牛的瘤胃微生物菌群代谢，改善牛乳质量[13]。Xu等[14]发现，仔猪饲粮中添加CEO可增强断奶仔猪的生长性能和免疫能力，降低大肠杆菌感染风险。CEO还可治疗鸡禽类小孢子菌感染的禽类皮肤癣菌病[15]。畜牧生产中常需添加大剂量精油才可发挥更好的作用，目前研究多集中在不同精油间或精油作为抗菌增效剂的协同作用，以此减少精油的使用量[16]。本试验旨在研究不同精油间的协同抑菌作用，为复配精油在生产实践中应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、MRSA29、MRSA85、MRSA95由广西大学中兽医实验室提供。LEO和CEO由江西雪松天然药用油有限公司提供，50 mg精油溶于1 mL 5% Tween 80，得原液（50 g/L），4 ℃保存。试验试剂：MHB培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司；S0026ATP检测试剂盒、S0033SROS检测试剂盒、S0131S脂质氧化（MDA）检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；A016-1-1ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。试验仪器：Regulus 8100扫描电子显微镜（日立公司）、UVmini-1240紫外分光光度计（津岛制作所）、Image Xpress pico荧光显微镜（蔡司集团）。1.2测定指标及方法1.2.1最小抑菌浓度（MIC）采用微量肉汤稀释法检测LEO和CEO对金黄色葡萄球菌的抗菌MIC，两种精油置于96孔微量滴定板，采用MHB培养基进行二倍稀释；混于相同体积的MHB菌悬液中（106 CFU/mL），总体积为100 μL，以无菌水做空白对照。在37 ℃、220 r/min条件下培养18 h，根据无肉眼可见的细菌生长时的浓度定义MIC。每个试验重复3次。1.2.2分级抑菌指数（FICI）参考Liu等[17]方法测定FICI。两种精油分别在含有50 μL MHB培养基的96孔微量滴定板上沿水平轴和垂直轴进行二倍稀释，混合，添加相同体积的细菌悬液（106 CFU/mL），试验重复3次。FICI=(LEO联合用药的MIC/LEO单独用药的MIC)+(CEO联合用药的MIC/CEO单独用药的MIC)(1)通过计算最小FICI值判断药物之间的相互作用效果，判断标准为：FICI≤0.5为协同效应；0.5FICI≤1.0为相加效应；1.0FICI≤2.0为无关效应；FICI2.0为拮抗效应。根据试验结果，后续试验分组为：LEO组（1/8 MIC）、CEO组（1/4 MIC），复方组：LEO（1/8 MIC）+CEO（1/4 MIC）组、2×复方组。1.2.3LEO、CEO及其复配精油对金黄色葡萄球菌生长的影响根据1.2.2结果，选择具有协同作用时的LEO和CEO浓度进行后续试验。菌株ATCC29213接种于4 mL MHB培养基，37 ℃、220 r/min培养过夜。稀释至106 CFU/mL，向细菌悬浮液中加入不同的精油，使总体积为4 mL，最终浓度为LEO（1/8 MIC）、CEO（1/4 MIC）、LEO（1/8 MIC）+CEO（1/4 MIC），对照组不添加精油。各组在相同条件下培养。以分光光度计在波长600 nm、间隔2 h、37 °C记录生长曲线。试验重复3次。1.2.4LEO、CEO及其复配精油对金黄色葡萄球菌细胞形态结构影响菌株ATCC29213在37 ℃、220 r/min振荡培养至对数生长期（6 h），3 500 r/min离心10 min，采用无菌0.01 mol/L PBS（pH值7.4）洗涤3次，在PBS中重悬至OD600 nm值为0.5。在菌悬液中添加不同浓度的精油：LEO（1/8 MIC）、CEO（1/4 MIC）、LEO（1/8 MIC）+CEO（1/4 MIC），以加无菌水做空白对照，37 ℃、220 r/min培养4 h。所有分组3 500 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀物加入戊二醛（2.5%），室温固定2 h。样品使用碳贴纸附着在金属存根，金溅射涂30 s，扫描电子显微镜观察并拍照。1.2.5LEO、CEO及其复配精油对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响菌株ATCC29213在37 ℃、220 r/min条件下振荡培养6 h，3 500 r/min离心10 min，无菌0.01 mol/L PBS（pH值7.4）洗涤3次，在PBS中重悬至OD600 nm值为0.5。在菌悬液中添加不同浓度精油，37 ℃孵育，以无菌水作空白对照。0、2、4、8 h收集菌悬液，3 500 r/min离心10 min，取上清液测定OD260 nm值和OD280 nm值。1.2.6LEO、CEO及其复配精油对金黄色葡萄球菌能量代谢影响菌株ATCC29213在37 ℃、220 r/min条件下振荡培养6 h，3 500 r/min离心10 min，无菌0.01 mol/L PBS（pH值7.4）洗涤3次，在PBS中重悬至OD600 nm值为0.5。在菌悬液中添加不同浓度的精油，无菌水作空白对照，37 ℃、220 r/min下培养4 h，离心得到菌沉淀，加入溶菌酶与ATP裂解液裂解，离心取上清。根据试剂盒说明检测胞内ATP含量以及ATP酶活性。1.2.7LEO、CEO及其复配精油对金黄色葡萄球菌氧化应激的影响菌株ATCC29213在37 ℃ 220 r/min条件下振荡培养6 h，3 500 r/min离心10 min，以无菌0.01 mol/L PBS（pH值7.4）洗涤3次，在PBS中重悬至OD600 nm值为0.5。在重悬液中加入荧光探针针DCFH-DA至终浓度10 μm/L，37 ℃下孵育30 min，无菌0.01 mol/L PBS（pH值7.4）洗涤3次，重悬。将装有探针的细菌重悬液加至96孔板，添加不同浓度精油孵育30 min。荧光酶标仪检测488 nm激发波长，525 nm发射波长的荧光强度，根据荧光强度计算胞内ROS含量。胞内MDA含量检测前精油处理方式相同，根据MDA试剂盒的使用方法检测其含量。1.3数据统计与分析试验数据采用SPASS 22.0软件进行单因素方差分析。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1LEO、CEO的MIC及FICI值（见表1）由表1可知，LEO的MIC范围为0.78~1.56 g/L，CEO的MIC范围为1.56~3.13 g/L。LEO和CEO的FICI值为0.250~0.375，表明LEO和CEO对金黄色葡萄球菌具有协同抑菌作用。通过对抗金黄色葡萄球菌（ATCC29213）效果比较发现，LEO使CEO的MIC降低至0.39 g/L；CEO使LEO的MIC降低至0.20 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.T001表1LEO、CEO的MIC及FICI值组别MIC单独/(g/L)MIC联合/(g/L)FICI值结果LEOCEOLEOCEOATCC292131.561.560.200.390.375协同效应MRSA950.783.130.200.390.375协同效应MRSA851.563.130.200.390.250协同效应MRSA291.561.560.200.390.375协同效应2.2LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌生长情况的影响（见图1）从图1可知，与对照组相比，单独添加LEO、CEO对金黄色葡萄球菌的生长无明显影响。添加复配精油时，金黄色葡萄球菌生长受到抑制，到达对数生长期的时间推迟，平台期细菌总量降低。随着复配精油浓度升高，金黄色葡萄球菌完全被抑制。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F001图1LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌生长情况的影响2.3LEO、CEO及其配精油对金黄色葡萄球菌形态结构的影响（见图2）由图2可知，金黄色葡萄球菌经LEO和CEO处理4 h后，表面出现皱缩、凹陷，甚至破裂；正常对照组的金黄色葡萄球菌呈光滑球形，结构完整。复方精油组中金黄色葡萄球菌的破损最明显；单独用药LEO、CEO时金黄色葡萄球菌仅有部分破损。细菌结构完整性的破损可导致胞内物质的泄漏，如核酸、蛋白质、离子等，最终导致细菌死亡。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F002图2LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌形态结构的影响2.4LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响（见图3）由图3可知，与对照组相比，在4、8 h时经复配精油以及LEO、CEO单独处理后菌液的OD260 nm及OD280 nm值显著升高（P0.05）。复配精油处理菌液的OD260 nm、OD280 nm值显著高于LEO、CEO单独处理（P0.05）。图3LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌细胞膜通透性的影响注：不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F3a1（a）OD260 nm值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F3a2（b）OD280 nm值OD260 nm值及OD280 nm值分别反映核酸的浓度、蛋白质的浓度，精油处理后OD260 nm、OD280 nm升高，表明金黄色葡萄球菌细胞通透性变大，导致其核酸以及蛋白质泄漏至胞外。2.5LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌胞能量代谢的影响（见图4）由图4（a）可知，与对照组相比，精油处理后金黄色葡萄球菌胞内ATP含量显著降低（P0.05）。复配精油处理后胞内ATP含量显著低于LEO、CEO单独处理（P0.05）。可能是精油的某些成分能导致细菌的能量代谢紊乱，使胞内ATP含量降低[18]。由图4（b）可知，精油处理后金黄色葡萄球菌胞内Na+/K+-ATP酶活性显著降低（P0.05）。复配精油处理后胞内Na+/K+-ATP酶活性显著低于LEO、CEO单独处理（P0.05）；表明精油能够导致细菌代谢紊乱。图4LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌细胞能量代谢的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F4a1（a）ATP含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F4a2（b）Na+/K+ ATP酶活性2.6LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌氧化损伤的影响（见图5）图5LEO、CEO及复配精油对金黄色葡萄球菌氧化损伤的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F5a1（a）ROS荧光强度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.016.F5a2（b）MDA相对含量由图5（a）可知，与对照组相比，精油处理后金黄色葡萄球菌胞内ROS含量显著升高（P0.05）。复配精油处理后胞内ROS含量显著高于LEO、CEO单独处理（P0.05）。表明精油处理后能够引起金黄色葡萄球菌发生氧化应激，使胞内ROS增加，造成不可逆的氧化损伤。由图5（b）可知，与对照组相比，精油处理后金黄色葡萄球菌胞内MDA含量显著升高复配精油处理后胞内MDA含量（P0.05）。复配精油处理后胞内MDA含量显著高于LEO、CEO单独处理（P0.05）。研究表明，精油能够引起金黄色葡萄球菌的胞内氧化应激，造成氧化损伤。3讨论3.1LEO、CEO对金黄色葡萄球菌的协同抗菌作用酚类和醛类含量较高的精油，如百里香、丁香、肉桂和牛至精油，通常具有更强的抗菌能力[19-20]。植物精油成分复杂，其抗菌机理也很复杂[21]。精油可破坏细菌细胞壁和细胞膜的结构、酶系统和能量代谢[22]。精油间存在协同抗菌作用[23]。本研究发现，LEO和CEO对金黄色葡萄球菌具有协同作用，但这种协同抗菌机制尚未见报道。3.2复配精油对金黄色葡萄球菌形态结构以及膜通透性的影响扫描电子显微镜（SEM）常用于检测细菌细胞壁的形态变化[24]。精油可直接破坏细菌细胞壁的结构，对细菌造成损伤[25]。本研究结果表明，LEO和CEO可直接损伤细菌细胞壁，且复配精油的效果更强。OD260 nm值和OD280 nm值在核酸和蛋白质浓度的检测中广泛应用[26]。CEO可引起大肠杆菌O157∶H7核酸泄露，导致菌液OD260 nm值提高[27]；肉桂精油可引起大肠杆菌蛋白质泄漏，提高菌液OD280 nm值[28]。因此，LEO和CEO联合使用时，二者协同损伤细胞形态结构，增加细胞膜的通透性，从而导致更多核酸和蛋白质泄漏。3.3复配精油对金黄色葡萄球菌能量代谢紊乱和氧化应激的影响精油能够引起细菌氧化应激，提高ROS含量，损害线粒体、磷脂、酶、核酸和生物膜[29]。MDA是脂质氧化的产物，随着细胞内ROS的增加而增加，可直接反映细胞氧化损伤的程度[30]。本研究中，LEO和CEO可对金黄色葡萄球菌造成氧化损伤，两种精油复配时可表现更显著的效果。此外，ROS可直接损伤线粒体，影响细菌能量代谢，故精油可影响细菌的呼吸代谢[31]。有研究表明，精油可影响细菌对碳水化合物的吸收和转化[32]。精油中的一些活性物质还可直接影响参与能量代谢途径的酶，如戊糖途径、糖酵解途径和三羧酸循环[33]。精油可直接引起细胞内ATP含量和ATP酶活性的变化[34]。本研究中，精油处理后细菌细胞中ROS和MDA含量增加，表明精油可引起金黄色葡萄球菌的氧化应激。4结论LEO、CEO对金黄色葡萄球菌具有协同抑菌作用，两种精油复配后协同抗菌机制可直接破坏金黄色葡萄球菌的细胞完整性，导致胞内大分子泄漏，影响细菌正常的生长。复配精油还能够引起金黄色葡萄球菌发生氧化应激，导致能量代谢紊乱，从而发挥抑菌作用。