抗生素常用于疾病预防和促进动物生长，但其不规范使用导致畜禽产品风味差、耐药性问题日益严峻[1]。我国已禁止在动物饲料生产中使用抗生素，因此寻找天然健康的新型饲料添加剂成为研究热点[2]。绿原酸可有效提高动物生产性能，具有抗炎、抗氧化功能、提升机体免疫能力的优点[3-5]。《中华人民共和国农业农村部公告 第217号》批准了绿原酸作为饲料添加剂在动物饲料生产中应用。杜仲叶价格相对较低且富含绿原酸，是提取绿原酸的重要来源[6]。本研究以杜仲叶为研究对象，考察不同采收时间下杜仲叶中绿原酸含量的差异性；以最佳采收时间下的杜仲叶为原料对绿原酸提取工艺参数进行正交优化，为合理开发杜仲叶资源以及优化绿原酸提取工艺提供参考。1材料与方法1.1试验材料杜仲叶由张家界市杜仲茶种植基地提供。分别于2021年5月至11月中旬获取无病虫危害且生长正常的杜仲叶，低温减压快速烘干，粉碎，过60目筛。收集各月份杜仲叶样品1 kg。1.2试验仪器101-2低温减压干燥箱（伟永兴仪器有限公司）；FW177粉碎机（泰斯特仪器有限公司）；AB204-S分析天平（瑞士梅特勒）；KQ5200DE超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；高效液相色谱、C18色谱柱（Waters公司）；0.45 μm微孔滤膜、溶剂过滤器、SHB-Ⅲ无油真空泵（长城科工贸有限公司）。1.3主要试剂CAS 327-97-9绿原酸标准品（HPLC，含量为96.2%）；甲醇（色谱纯，博迪化工有限公司）；乙腈（色谱纯，科密欧化学试剂开发中心）；磷酸（西安化学试剂厂）；盐酸（分析纯，西安化学试剂厂）；自制纯化水和无离子水。1.4绿原酸的检测绿原酸的检测方法参考中国医药保健品进出口商会团体标准《植物提取物 绿原酸》(T/CCCMHPIE 1.17—2016）。1.4.1色谱条件色谱柱：Hypersil Gold C18 （4.6 mm × 250 mm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.4%磷酸溶液；洗脱程序为A相∶B相=9∶91；检测波长：327 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：35 ℃。1.4.2系统适用性试验理论塔板数按照绿原酸峰计算不得低于6 000。1.4.3操作步骤取绿原酸标准品适量，加入50%甲醇制成0.2 g/L的绿原酸溶液。取杜仲叶（或提取物）样品约0.1 g，置于50 mL量瓶中，加入50%甲醇溶液溶解，稀释至刻度线，摇匀，精确量取1 mL用50%甲醇稀释至10 mL，摇匀，滤过，得供试品溶液。根据进样量要求，吸取对照品与供试品溶液各10 μL注入液相色谱，测定比统计绿原酸峰面积，计算绿原酸质量分数。w1=A1×C1×V1As1×m1×P×100% (1)式中：w1为供试品中绿原酸的质量分数（%）；A1为供试品溶液中绿原酸的峰面积；C1对照品溶液的浓度（g/L）；V1为供试品溶液的稀释体积（mL）；As1对照品溶液中绿原酸的峰面积；m1为供试品的称样量（mg）；P为绿原酸标准品的纯度（%）。1.5绿原酸提取工艺优化研究根据上述步骤将所有月份杜仲叶中绿原酸含量测定完毕，以绿原酸含量最高的杜仲叶为材料，精确称量其粉末约3 g转移至提取瓶，以水作为提取溶剂，通过单因素试验考察各个因素最佳取值范围。在此基础上，对杜仲叶绿原酸水提取工艺进行正交优化，以获得其最佳提取工艺参数。计算绿原酸得率（R，%）。R=W1×103/W2×100% (2)式中：W1为所得提取物中绿原酸的质量（mg）；W2为用于提取的杜仲叶质量（g）。1.5.1单因素试验本研究中，杜仲叶绿原酸提取的初始工艺参数设定为：液料比8 mL/g、提取时间70 min、提取温度65 ℃。在基于其他种因素处于初始工艺参数条件下，按顺序分别考察液料比（6、8、10、12、14 mL/g），提取时间（50、60、70、80、90 min）和提取温度（55、60、65、70、75 ℃）对绿原酸得率的影响。每个工艺下重复提取3次，取平均值。1.5.2正交试验设计在单因素试验基础上，以液料比（A）、提取时间（B）和提取温度（C）为考察因素，以绿原酸得率为指标，设计3因素3水平的正交优化试验，正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.T001表1正交试验因素水平设计水平A/(mL/g)B/minC/℃187055210806031290651.6数据统计与分析不同月份杜仲叶绿原酸含量重复测定6次。试验数据采用Excel软件进行初步整理，SPSS 2021软件进行单因素方差分析，对正交试验进行极差分析。2结果与分析2.1不同采摘时间下杜仲叶绿原酸含量变化规律（见图1）由图1可知，5月至7月，杜仲叶绿原酸含量呈上升趋势；8月后，杜仲叶绿原酸含量逐步下降；5月至11月，杜仲叶中绿原酸含量基本呈抛物线变化规律。因此，在提取工艺优化的研究中，选择7月杜仲叶为研究材料进行后续研究。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.F001图1不同采摘时间下杜仲叶绿原酸含量变化规律2.2单因素试验结果2.2.1液料比对杜仲叶提取绿原酸得率的影响（见图2）由图2可知，随着液料比的上升绿原酸得率逐渐提高，10 g/mL时逐步趋于稳定。因此，认为绿原酸提取工艺中最适液料比在8~12 g/mL范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.F002图2液料比对杜仲叶提取绿原酸得率的影响2.2.2提取时间对杜仲叶提取绿原酸得率的影响（见图3）由图3可知，随着提取时间的延长，绿原酸得率逐渐提高，80 min时达到最高，为1.46%，之后开始下降。因此，认为绿原酸提取工艺中最适提取时间在于70~90 min范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.F003图3提取时间对杜仲叶提取绿原酸得率的影响2.2.3提取温度对杜仲叶提取绿原酸得率的影响（见图4）由图4可知，在提取温度达到60 ℃时，绿原酸得率达到最高值1.33%，只有绿原酸得率逐渐下降。因此可以认为绿原酸提取工艺中最适提取温度处于55~65 ℃范围内。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.F004图4提取温度对杜仲叶提取绿原酸得率的影响2.3正交试验优化结果严格按照正交试验表中各项工艺参数对杜仲叶中绿原酸重复提取3次取平均值，正交试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.T002表2正交试验结果项目A/(mL/g)B/minC/℃绿原酸得率/%1880551.562870651.183890601.2441080601.5851090551.3361070651.5971280551.5881290651.0691270601.51K13.984.284.47K24.504.724.33K34.153.633.83k11.331.431.49k21.501.571.44k31.381.211.28R0.170.360.21因素主次BCA较优水平A2B2C1由表2可知，根据极差分析R值大小可知，3个因素对绿原酸得率的影响排序为提取时间提取温度液料比；根据k值可知，绿原酸提取最佳工艺参数为液料比10 g/mL、提取时间80 min、提取温度55 ℃。正交试验方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.T003表3正交试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值截距17.72117.7203 692.520.000A0.0520.0204.880.170B0.2020.10020.880.046C0.0820.0407.920.112残差0.0120.005总计0.348由表3可知，仅提取时间对绿原酸得率具有显著影响（P0.05）。2.4最优工艺参数条件下绿原酸得率（见表4）在液料比10 g/mL、提取时间80 min、提取温度55 ℃条件下，对7月杜仲叶中绿原酸进行提取，重复6次。由表4可知，在最佳工艺参数条件下，绿原酸平均得率为1.60%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.15.018.T004表4最优工艺参数条件下绿原酸得率项目123456平均值绿原酸得率1.571.601.581.611.591.621.60%3讨论3.1采收时间对杜仲叶中绿原酸含量的影响杜仲是传统中药材，其药用部位为杜仲树皮及根部，药效随着植物存活年限而显著上升。由于杜仲与杜仲叶使用成本较高并不适用于动物养殖，且主要活性成分均为绿原酸[7-8]，故杜仲叶及其提取物在动物生产中的应用相对更易推广与应用。杜仲叶在畜禽养殖中的开发与利用方式主要包括原材料打粉、杜仲叶提取物等两种方式。中药提取物可获取更高浓度的活性物质，获得更好的抗炎、抗菌及抗氧化效果[9]。考察不同时间杜仲叶中绿原酸含量有助于采收过程中获得更为优质的提取原料，充分发挥杜仲叶的经济价值[10]。本研究结果表明，7月杜仲叶绿原酸平均含量（1.97%）高于其他月份，但不同的文献中对以绿原酸含量最高确定杜仲叶最佳采收时间的结论不完全一致。魏锐[11]研究认为，6月杜仲叶中绿原酸含量最高，为2.22%，而何希瑞等[12]研究认为，8月至9月杜仲叶中绿原酸含量超过其他时间，为0.912%。造成不同的报道中绿原酸最佳采收月份存在较大差异的原因可能为绿原酸产地的自然环境存在差异[13]、采收后干燥方式[14]和贮存条件不一致等[11]。但杜仲叶在夏季中所含绿原酸的整体水平高于其他季节。3.2杜仲叶中绿原酸提取工艺分析杜仲叶提取工艺的优化有助于充分开发杜仲叶的经济价值，可通过获得更高效的提取工艺参数尽可能降低绿原酸在畜禽养殖中的使用成本。目前，杜仲叶的提取方法包括水提取法、醇提取法、超声波提取、酶法提取等多种方法[15-17]。利用水提取法可使绿原酸的提取率可超过80%，其他方法绿原酸提取率已超过90%[18]；但在实际应用生产中，其他方法的制造成本高于水提取法，更适用于医药、食品等对原料要求更高的行业[19-20]。《饲料原料品种目录》明确规定了杜仲叶粗提物可长期用于动物饲料生产，本研究所使用的水提取法在降低杜仲叶提取物绿原酸使用成本方面更具优势。4结论本研究结果表明，7月为杜仲叶最佳采收时间，在液料比10 g/mL、提取时间80 min、提取温度55 ℃的工艺参数下，绿原酸得率最高，可充分发挥杜仲叶绿原酸在畜禽养殖中的应用价值。