纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）能够产生芽孢结构，具有较强的抗逆性[1-2]，是市场中常用的益生菌之一[3]。纳豆芽孢杆菌产生的纳豆激酶具有溶血栓效果，纳豆芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂具有广阔的开发前景[4]。目前纳豆芽孢杆菌发酵工艺较为成熟[5]，本试验对该菌进行200 L液体发酵罐发酵，后期对其干燥处理，制备可长期保存使用的菌粉；并在海兰褐蛋鸡日粮添加纳豆芽孢杆菌粉，发挥纳豆芽孢杆菌的益生作用，为其在动物实际生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌种纳豆芽孢杆菌菌株由本学院微生物实验室选育。1.1.2试验动物筛选300只34周龄健康的海兰褐蛋鸡，由潍坊市某鸡场提供。1.1.3培养基TSB培养基、LB培养基（北京奥博星生物技术有限责任公司）。玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆购自附近食品厂。1.2试验方法1.2.1菌粉制备1.2.1.1培养基制备斜面培养基（LB培养基）：用量3%，pH值7.0。种子培养基（普通肉汤培养基）：用量3%，pH值7.0。发酵培养基：具体用量为玉米淀粉1%、豆粕粉2%、玉米浆0.5%、K2HPO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、MnSO4 0.02%，pH值7.0。计数培养基（LB培养基）：pH值7.0。1.2.1.2菌种培养试管斜面培养：取菌种管内一环菌液接种于斜面培养基，37 ℃培养24 h。种子液体试管培养：制备若干支10 mL试管的液体培养基，37 ℃培养24 h。摇瓶种子培养：以5%的接种量接种到锥形瓶内，37 ℃培养24 h。种子罐培养：50 L种子罐中装液量30 L；接种量5%、温度37 ℃、搅拌转速200 r/min、培养24 h。发酵罐培养：以5％的接种量将纳豆芽孢杆菌接种于200 L发酵罐进行培养，设置温度37 ℃、发酵搅拌转速150 r/min，培养4 h；每隔2 h取样分析，测量菌体、芽孢的浓度，添加0.3％的豆油作消泡剂。活菌数量测定：参照温崇庆等[6]方法采用活菌计数法进行计数。芽孢数量的测定：参照温崇庆等[6]方法计算芽孢数。1.2.1.3喷雾干燥制备菌粉以糊精为保护剂，用量为发酵液的10%，通过喷雾干燥法制备纳豆芽孢杆菌菌粉。1.3饲养试验1.3.1试验设计选取选300只34周龄的健康海兰褐蛋鸡，随机分为5组，试验1组（对照组）蛋鸡饲喂基础日粮，试验2组、试验3组、试验4组、试验5组分别在基础日粮中添加0.01%、0.05%、0.10%、0.20%的纳豆芽孢杆菌菌粉。试验期42 d。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.010.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米62.00代谢能/(MJ/kg)11.00豆粕17.00粗蛋白/%17.00棉粕5.00钙/%3.60菜籽粕5.00磷/%0.50石粉8.20赖氨酸/%0.70磷酸氢钙1.50蛋氨酸/%0.50食盐0.301%预混料1.00注：1.预混料成分参照董尚智等[7]研究进行设计。预混料为每千克日粮提供：VA 8 000 IU、VD3 3 000 IU、VE 20 IU、VB1 1.30 mg、VB2 3.60 mg、VB6 1.50 mg、VK 31.50 mg、D-泛酸12.00 mg、胆碱450.00 mg、叶酸0.50 mg、烟酸26.50 mg、Fe 62.00 mg、Mn 62.00 mg、Zn 40.00 mg、Cu 10.00 mg、Se 0.30 mg、I 0.50 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3.2测定指标及方法1.3.2.1生产性能正式试验期开始，每日以重复为单位记录蛋鸡当日产蛋数、总蛋重，计算平均蛋重、产蛋量、产蛋率。每周定时称量饲料，以重复为单位计算平均日采食量和料蛋比，记录淘汰鸡、病死鸡死淘数，计算死淘率。产蛋率=产蛋数/试验鸡数(1)平均蛋重=合格蛋总重/合格蛋数(2)料蛋比=平均采食量/平均蛋重(3)死淘率=各栏累计死淘鸡/各栏累计饲养鸡(4)1.3.2.2蛋品质蛋壳强度：将完整的鸡蛋置于蛋壳强度分析仪（ESTG-01型）进行检测；蛋黄颜色、蛋白高度与哈夫单位使用蛋品质分析仪（DET-6000型）分别测定；蛋壳厚度使用蛋壳厚度测定仪（NFN-380型）测定蛋的锐端、钝端和中部3部分的蛋壳厚度，取其平均值。1.3.2.3盲肠微生物计数无菌条件下，称取盲肠食糜1 g，经选择性培养基培养后，在平皿上计算相应活菌数。1.3.2.4血清生化指标在蛋鸡40周龄，从各组中随机抽取5只蛋鸡，翅下静脉采血1 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存。血清生化指标使用日立7180全自动生化分析仪检测。参考文献[8]测定总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）含量。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1纳豆芽孢杆菌发酵生长曲线（见图1）由图1可知，20 h后纳豆芽孢杆菌浓度达到2.31×1010 CFU/mL，芽孢最大值达到96%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.010.F001图1纳豆芽孢杆菌发酵生长曲线2.2纳豆芽孢杆菌菌粉活菌数采用糊精作为纳豆芽孢杆菌干燥的保护剂，干燥后菌粉经活菌计数，活菌数达1.76×1011 CFU/g。2.3纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡生产性能及蛋品质的影响2.3.1纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡生产性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，各试验组蛋鸡产蛋率均显著升高（P0.05），料蛋比、死淘率显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.010.T002表2纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡生产性能的影响组别产蛋率/%平均蛋重/(g/枚)料蛋比死淘率/%试验1组（对照组）90.1±0.4b61.1±0.22.51±0.40a3.1±0.6a试验2组92.3±0.3a61.5±0.32.43±0.30b2.0±0.3b试验3组93.0±0.2a61.2±0.32.45±0.20b1.9±0.2b试验4组92.6±0.3a61.3±0.22.42±0.30b1.9±0.3b试验5组93.8±0.2a61.7±0.42.40±0.20b1.7±0.2b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3.2纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡蛋品质的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，各试验组鸡蛋的蛋黄颜色、蛋壳厚度均显著提高（P0.05），试验4组、试验5组鸡蛋的哈夫单位显著提高（P0.05），纳豆芽孢杆菌对蛋壳强度及蛋白高度无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.010.T003表3纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡蛋品质的影响组别蛋黄颜色蛋壳厚度/mm蛋壳强度/(N/cm2)蛋白高度/mm哈夫单位试验1组（对照组）10.20±0.51b0.330±0.050b4.90±0.546.24±0.7575.80±1.52b试验2组10.78±0.47a0.342±0.030a4.95±0.466.35±1.4776.35±2.45b试验3组10.92±0.62a0.350±0.040a5.02±0.626.21±1.1276.83±1.75b试验4组11.23±0.54a0.361±0.050a4.97±0.456.41±0.9178.40±2.31a试验5组11.42±0.59a0.369±0.030a5.04±0.526.50±0.8278.52±2.14a2.4纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡肠道微生物的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，各试验组蛋鸡肠道内的乳酸菌数量均显著升高（P0.05），且各试验组蛋鸡肠道内的大肠杆菌、沙门氏菌数量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.010.T004表4纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡肠道微生物的影响组别乳酸菌大肠杆菌沙门氏菌试验1组（对照组）7.92±0.35b7.83±0.30a6.75±0.15a试验2组8.21±0.20a7.55±0.20b6.52±0.13b试验3组8.52±0.15a7.21±0.15b6.23±0.15b试验4组8.94±0.12a6.86±0.25b6.21±0.10b试验5组9.12±0.10a6.65±0.20b5.94±0.12blgCFU/g2.5纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡血清生化指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验4组、试验5组TP、GLB含量均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.010.T005表5纳豆芽孢杆菌对海兰褐蛋鸡血清生化指标的影响组别TP/(g/L)ALB/(g/L)GLB/(g/L)GLU/(mmol/L)TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)试验1组（对照组）48.05±1.58b23.38±0.6724.67±0.65b14.02±0.7812.23±1.2113.54±1.25试验2组48.38±2.13b23.46±1.0224.92±1.25b14.38±0.6712.15±1.1613.42±1.18试验3组48.26±1.79b23.42±1.2424.84±1.52b14.20±0.5312.31±1.0213.61±1.05试验4组51.06±1.47a23.86±0.5427.20±0.82a14.19±0.8612.11±1.2313.21±1.28试验5组51.65±1.75a23.90±0.9227.75±0.72a14.32±0.4512.06±1.1513.75±1.243讨论3.1纳豆芽孢杆菌对蛋鸡生产性能及蛋品质的影响本研究中，产蛋高峰期的海兰褐蛋鸡饲喂含不同浓度的纳豆芽孢杆菌菌粉可提高蛋鸡产蛋率及蛋品质，与Samanya等[9]试验结果一致。Cartman等[10]研究表明，纳豆芽孢杆菌可提高鸡的胃肠道代谢功能，本试验也得到相似结论。Chen等[11]研究表明，纳豆芽孢杆菌可以改善蛋鸡生长性能和蛋品质，但对蛋重无明显影响。益生菌制剂可使动物的肠道菌群保持相对的动态平衡，提高动物的新陈代谢能力[12]。原因可能是纳豆芽孢杆菌在蛋鸡肠道内生长繁殖代谢的过程中产生了一些营养分子，如维生素类、有机酸类以及一些酶类等物质[13]，可增强蛋鸡对饲料的吸收，进而改善蛋鸡生产性能及蛋品质。3.2纳豆芽孢杆菌对蛋鸡肠道微生物的影响益生菌制剂可促进动物小肠绒毛的生长[14]，从而增加肠道与营养物质的接触面积；益生菌制剂可对肠道内的致病菌产生竞争、拮抗等作用，在生长繁殖过程中产生一些具有抗菌作用的代谢产物[15]，从而抑制病原微生物在动物肠道内的生长繁殖。益生菌产生的营养物质，如维生素、有机酸等可促进肠道内有益菌的生长繁殖[16]。因此，动物肠道微生物种类及数量的变化直接影响肠道的健康和消化能力。益生菌制剂可通过调节动物肠道菌群结构，提高宿主的免疫力，进而保持动物机体健康[17]。3.3纳豆芽孢杆菌对蛋鸡血清生化指标的影响血清中的TP、ALB及GLB可以反映动物的免疫水平以及动物对氨基酸及蛋白质的利用程度。本试验中，试验4组、试验5组蛋鸡血清TP、GLB含量均显著提高。贾聪慧等[18]对肉鸡使用了丁酸梭菌制备的微生态制剂后，肉鸡血清TP含量显著提高。本试验中，使用纳豆芽孢杆菌后，对蛋鸡血清GLU、TC及TG含量的影响不明显。但有研究发现，使用复合微生态制剂后可降低肉鸡血清GLU、TG含量[19]。造成差异的原因可能与动物品种、微生态制剂及使用量不同有关，有待进行更深入的研究。4结论纳豆芽孢杆菌制备的微生态饲料添加剂能够改善海兰褐蛋鸡机体的健康状况，改善生产性能及蛋品质。