集约化养殖过程中，畜禽应激是影响其生长性能的重要因素之一。南方地区夏季高温高湿的气候环境引起的热应激可对牛产生极大的负面影响，导致牛采食量下降、体温升高、生长缓慢等，给养殖场造成经济损失[1]。除饲养管理外，可通过营养调控手段缓解热应激。很多天然植物中含有多种活性物质，具有改善动物生长性能、提高免疫功能等多种功效[2-3]。研究表明，奶牛日粮中添加45 g/d茶皂素可提高血清中IL-16 mRNA的表达量[4]。0.25和0.50 g/kg柴胡提取物可降低热应激奶牛呼吸频率和直肠温度，显著提高干物质采食量和产奶量，改善奶牛泌乳性能[5]。夏季高温条件下，日粮中添加0.2%或0.6%金银花绿原酸可提高锦江黄牛血清总抗氧化能力（T-AOC）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、SOD活性，降低MDA含量，提高血清总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）含量，促进机体蛋白质代谢，提高抗氧化能力，缓解热应激反应[1]。奶牛日粮中添加200 g/d的黄芪组方中草药添加剂可提高奶牛产奶量、乳脂率和乳蛋白率，降低血清内毒素、HSP70和MDA含量，提高GSH-Px活性[6]。莲在我国分布广泛，资源丰富。莲子钻芯粉是莲子加工副产物，主要包含莲子芯及少量莲子粉，主要功效型成分为生物碱类化合物，具有抗炎、抗氧化等多种生理功能[7-8]。荷叶中富含黄酮、生物碱类物质，具有抗菌消炎、增强免疫、清除自由基抗氧化、维持机体代谢过程中氧化还原状态稳定等作用[9-10]。在黄羽肉鸡日粮中添加0.1%荷叶提取物可改善肉色，显著提高肌肉GSH-Px活性和T-AOC，降低MDA含量，有助于改善肉品质[11]。但目前关于莲子芯、荷叶及其副产物在反刍动物生产中的应用尚未见报道，其富含的功效型成分对反刍动物具有潜在的有益作用，具备一定的研究价值。本试验探究在日粮中添加以荷叶粉、莲子钻芯粉为主要成分的复合饲料添加剂对夏季高温条件下肉牛生长性能、抗氧化能力及免疫功能的影响，为其在夏季肉牛生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料莲子钻芯粉、荷叶粉由湖北莲由生态农业有限公司提供；茶多酚由江西富之源生物科技有限公司提供，有效物质含量大于98%；包被维生素C（VC）由杭州天农生物营养技术有限公司提供，有效物质含量大于95%。1.2试验设计选用32头体重约370 kg、健康无疾病的西门塔尔牛，随机分为2组，每组16个重复，每个重复1头牛。对照组牛饲喂基础日粮，试验组牛在基础日粮中添加45 g/d复合饲料添加剂（由57.22%莲子钻芯粉、36.67%荷叶粉、3.89% VC、2.22%茶多酚组成）。基础日粮组成及营养水平见表1。预试期6 d，正式试验期30 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0青贮玉米秸秆45.5粗蛋白质/%10.22麦秸18.2钙/%0.45玉米21.8磷/%0.26豆粕5.5净能/(MJ/kg)6.82麦麸6.5碳酸氢钠0.7预混料1.8注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 4 050 IU、VD 1 080 IU、VE 20 mg、铁43 mg、铜11 mg、锌56 mg、锰59 mg、钴0.13 mg、碘0.21 mg、硒0.18 mg。2.营养水平均为计算值。1.3测定指标及方法1.3.1牛舍温湿指数试验期间，在对照组和试验组栏内中央，距离地面1.5 m处悬挂温湿度表，每日测量并记录牛舍内的温度和相对湿度，换算温湿指数（THI）。THI=0.81×T+RH×（0.99×T-14.3）+46.3(1)式中：T为牛舍摄氏温度（℃），RH为相对湿度（%）。1.3.2生长性能试验过程中每日记录采食量，分别于试验前、试验后对每组试验牛逐只进行空腹称重，计算平均日增重和料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)平均日干物质采食量=（喂料量-剩料量）×日粮干物质含量/试验天数(3)料重比=平均日干物质采食量/平均日增重(4)1.3.3血清生化指标试验结束时每组随机选取8头牛尾静脉采血，分离血清，测定试验牛血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）活性以及总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）采用TBA120FR全自动生化分析仪（日本东芝）进行测定。1.3.4血清抗氧化指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定试验牛血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量，具体方法按说明书进行。1.3.5血液总RNA的提取及反转录试验结束时每组随机选取8头牛采集血液样本，使用天根生化科技有限公司的RNALock血液RNA稳定剂进行保存。利用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒提取血液样本中总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，制备好的RNA样本保存于-80 ℃冰箱。RNA样本的反转录采用Thermo Scientific公司的RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis kit进行，具体步骤参见说明书。1.3.6荧光定量PCR检测相关基因mRNA的表达变化采用SYBR Green Master Mix进行荧光定量PCR检测。反应体系（15 μL）：2×qPCR Mix 7.5 μL、上下游引物（2.5 μmol/L）1.5 μL、cDNA模板2 μL，ddH2O补至15 μL。每个样本重复3次。定量PCR在Bio-Rad CFX实时荧光PCR仪上进行，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；熔解曲线采集程序为65~95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。荧光定量PCR引物序列见表2。目的基因mRNA的相对表达量使用2-△△Ｃt法进行计算，对照组各目的基因的相对表达量校正为1，试验组的表达量为对照组表达量的倍数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.T002表2引物序列信息基因引物序列（5'→3'）产物长度/bpGenBank登录号IL-2F：ACATTTGACTTTTACGCGCCCAAGR：AATGAGAGGCACTTAGTGATC186NM_180997.2TNF-αF：ACTCGTATGCCAATGCCCTCAR：AGGGCTCTTGATGGCAGACAG212NM_173966.3HSP70F：GACGGAGACAAGCCTAAGGTGR：CGCTGCGAGTCGTTGAAGTA176NM_203322.3ACTBF：TCACCAACTGGGACGACATGR：CCCTCATAGATGGGCACCGT277NM_173979.3引物序列信息见表2。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，t检验对两组数据进行比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1高温条件下试验牛舍环境温湿指数变化（见表3）由表3可知，整个试验期内，THI均大于72，表明试验牛处于持续热应激状态。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.T003表3高温条件下试验牛舍环境温湿指数变化时间环境温度/℃相对湿度/%THI7月30日—8月4日32.83±2.4942.94±9.8180.57±1.568月5日—8月14日33.36±3.5142.70±9.1581.12±2.608月15日—8月24日33.67±2.6846.40±6.1682.37±2.798月25日—9月3日30.47±2.8946.50±6.0678.26±3.012.2复合饲料添加剂对高温条件下肉牛生长性能的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，试验组牛平均日增重提高了6.25%，平均日干物质采食量提高了1.84%（P0.05）。研究表明，在热应激情况下，添加复合饲料添加剂具有提高牛生长性能的趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.T004表4复合饲料添加剂对高温条件下肉牛生长性能的影响组别初重/kg末重/kg平均日增重/[kg/(头·d)]平均日干物质采食量/[kg/(头·d)]料重比对照组367.50±31.22410.94±37.241.44±0.3212.51±0.158.69±0.75试验组372.18±32.76418.13±32.551.53±0.2112.74±0.228.33±0.812.3复合饲料添加剂对高温条件下肉牛血清生化、抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验组牛血清T-SOD活性显著升高（P0.05），MDA含量显著降低（P0.05），表明在热应激情况下，添加复合饲料添加剂可缓解热应激对奶牛造成的氧化损伤。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.T005表5复合饲料添加剂对高温条件下肉牛血清生化、抗氧化指标的影响项目对照组试验组ALT/(U/L)46.37±8.7144.77±8.75AST/(U/L)94.55±4.9684.78±8.58AKP/(U/L)149.44±11.30159.90±10.27TP/(g/L)64.96±3.4666.99±3.13ALB/(g/L)35.76±1.5834.10±1.23TG/(mmol/L)0.15±0.030.21±0.04TC/(mmol/L)2.67±0.23a2.23±0.35bT-SOD/(U/mL)30.68±3.98b39.95±5.32aGSH-Px/(U/mL)95.89±5.6493.08±9.55MDA/(μmol/L)4.21±0.43a3.50±0.48b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.4复合饲料添加剂对高温条件下肉牛血液免疫相关基因及HSP70相对表达量的影响（见图1）由图1可知，与对照组相比，试验组牛血液中IL-2和HSP70 mRNA的表达量显著降低（P0.05）。图1复合饲料添加剂对高温条件下肉牛血液免疫相关基因及HSP70相对表达量的影响注：“*”表示差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.F1a1（a）血液IL-2 mRNA相对表达量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.F1a2（b）血液TNF-α mRNA相对表达量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.002.F1a3（c）血液HSP70 mRNA相对表达量3讨论3.1复合饲料添加剂对高温条件下肉牛生长性能的影响黄酮类化合物是植物中的次生代谢产物，具有抗氧化、调节机体免疫等多种功能[12]。刘艳丰等[13]研究发现，在阿勒泰羊日粮中添加沙棘叶黄酮可提高其平均日增重和饲料效率，增加血清TP和尿素氮含量。在犊牛日粮中添加桑叶黄酮可提高其断奶后的总能代谢率以及对氮的利用率，显著增加瘤胃总挥发性脂肪酸的浓度，从而改善瘤胃发酵[14]。夏季高温高湿，会造成动物采食量和体增重的显著下降，对其生长性能产生负面影响[15]。本试验中，复合饲料添加剂具有提高热应激肉牛平均日增重和干物质采食量的趋势，与上述研究结果相似。3.2复合饲料添加剂对高温条件下肉牛血清生化、抗氧化指标的影响血清TP和ALB可反映机体对蛋白质的代谢状况。本试验中，添加本复合饲料添加剂可提高肉牛血清TP的含量，与刘艳丰等[13]研究结果一致。胆固醇不仅参与细胞膜的形成，也是合成胆汁酸的原料，是机体不可缺少的重要物质。本试验中，添加本复合饲料添加剂可提高肉牛血清TG含量，表明对机体脂肪代谢具有一定的抑制效应。热应激主要是通过破坏动物机体内氧化与抗氧化系统平衡使机体产生氧化应激，造成机体免疫力下降，引发炎症反应。自由基过量产生导致脂质过氧化，最终造成细胞损伤[16]。MDA是衡量机体抗氧化防御系统功能的综合性指标[17]。SOD是机体内对抗自由基的第一道防线，GSH-Px可清除超氧阴离子自由基，二者对机体的氧化与抗氧化平衡起关键作用[18]。Li等[19]研究发现，43 ℃热应激会显著降低SOD、GSH-Px等抗氧物酶活性，提高MDA含量。本试验中，夏季高温条件下添加使用复合添加剂，可显著提高肉牛血清SOD活性，降低MDA含量，从而提高机体抗氧化能力，降低热应激对机体的氧化损伤。IL-2是启动炎症反应的关键细胞因子，能够促进CTL细胞、Th细胞及NK细胞释放细胞因子[20]。本试验中，添加复合饲料添加剂可显著降低IL-2分泌量，从而缓解热应激导致的炎症反应。4结论本研究结果表明，夏季高温条件下，在日粮中添加由荷叶粉、莲子钻芯粉、茶多酚和VC组成的复合饲料添加剂可提高肉牛平均日增重及血清抗氧化能力，显著降低HSP70 mRNA表达，具有缓解热应激反应的作用。