百香果因具有菠萝、香蕉等十几种水果的香味而得名[1]，被誉为“果汁之王”[2]。广西是我国最大的百香果生产基地[3]。张耀等[4]研究发现，百香果果皮和果藤具有较高的瘤胃降解率，是反刍动物粗饲料的优质来源。Sena等[5]研究表明，日粮中添加百香果果皮能够提高公羊的屠宰率。文良娟等[6]研究发现，百香果果皮富含多糖、果胶、黄酮等生物活性物质。百香果果皮中的黄酮类化合物具有多种生物活性[7]，在动物健康保护以及慢性疾病预防中具有积极作用[8]，在机体中具有抗氧化[9]、免疫调节[10]、抗胃溃疡等功效，能够促进动物繁殖、泌乳和生长[11-12]。果皮中黄酮类物质的提取方法包括索氏提取器提取法、超声波辅助提取法[13]、逆流提取法[14]等。超声波辅助提取法具有效率高、提取时间短、能耗低等优点[15]。响应面分析能够确定最佳工艺参数，广泛应用于工艺优化设计[16-17]。使用傅里叶红外光谱分析植物类黄酮结构的应用逐渐增多，但目前对百香果果皮中总黄酮的研究相对较少。本文采用超声波-微波辅助提取法提取百香果果皮中的总黄酮，研究百香果果皮总黄酮的抗氧化能力，为百香果果皮总黄酮的综合利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料百香果外皮无损伤、无腐败，购自锦州大润发超市。153-18-4Rutin芦丁标准品、117-39-5槲皮素标准品（HPLC≥98%）购自江西佰草源生物科技有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、溴化钾、无水乙醇及甲醇、甲酸均由锦州医科大学实验室提供。1.2试验仪器203-00T电热鼓风干燥箱（江苏光合实验室仪器有限公司）、UV-5100B紫外分光光度计（鸿运实验仪器批发中心）、RE-52蒸发器（上海书培实验设备有限公司）、KQ-202KDB高功率数控超声波清洗器（超声波仪器有限公司）、FW-135高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）、TD5M低速离心机（鑫贝西生物技术有限公司）、冷冻干燥机（宁波市双嘉仪器有限公司）、G70F20CN1L-DG微波炉（广东格兰仕集团有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1百香果果皮粉末样品制备果皮去瓤，切块，60 ℃烘箱中烘干，粉碎，过40目筛，2~4 ℃密封保存。1.3.2单因素试验参照文献[18]至文献[20]的提取方法，稍作修改。准确称取1.000 g百香果果皮粉末，超声温度为50 ℃，分别研究液料比（mL/g）、乙醇浓度（%）、超声功率（W）、超声时间（min）、微波时间（min）、微波功率（W）对百香果果皮总黄酮提取率的影响。提取基本条件为液料比50 mL/g、乙醇浓度70%、超声功率220 W、超声时间25 min、微波时间3 min、微波功率400 W。各单因素水平为液料比30、40、50、60、70 mL/g；乙醇浓度40%、50%、60%、70%、80%；超声功率160、180、200、220、240 W；超声时间10、15、20、25、30 min；微波时间1、2、3、4、5 min；微波功率200、300、400、500、600 W。1.3.3响应面优化设计分析单因素试验结果，选取液料比（A）、乙醇浓度（B）、提取时间（C）、微波功率（D）为主要因素，利用Design-Expert 10.0.3软件设计优化试验方案[21-22]。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.T001表1响应面试验因素水平设计水平A/(mL/g)B/%C/minD/W-1406020300050702540016080305001.3.4芦丁标准曲线绘制（见图1）配制浓度为0.20 g/L芦丁标准品溶液，参考文献[23]方法进行试验。芦丁标准曲线为y=9.044 29x+0.003 29，R2=0.996 9。芦丁标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F001图1芦丁标准曲线1.3.5百香果果皮总黄酮的提取及提取率的计算根据文献[18]方法稍作修改，称取2 g的百香果果皮粉末，按照1.3.3得到的最佳提取工艺提取总黄酮，提取液5 000 r/min离心12 min），浓缩近15 mL，滤入25 mL容量瓶，50%乙醇定容得总黄酮提取液，4 ℃保存。向10 mL比色管加3.00 mL总黄酮提取液，按照1.3.4测吸光度，计算总黄酮提取液浓度及总黄酮提取率。总黄酮提取率=cvn/m×100%(1)式中：c为总黄酮浓度（g/L）；v为总黄酮提取液体积（mL）；n为稀释倍数；m为果皮粉末质量（mg）。1.3.6百香果果皮总黄体酮粗提液的纯化根据文献[24]、文献[25]方法进行纯化，精密称取20 g AB-8大孔树脂，置于100 mL锥形瓶，准确加入已知质量浓度的百香果果皮总黄酮提取液30 mL，上样流速1.0 mL/min、洗脱流速2.0 mL/min，恒温水浴（30 ℃）振荡2 h，静置24 h，过滤得饱和吸附大孔树脂，加入30 mL 95%乙醇溶液解吸至无色，吸取上层清液，旋转蒸发至膏状，真空冷冻干燥24 h，取粉。1.3.7百香果果皮总黄酮抗氧化性试验1.3.7.1OH·清除能力根据文献[26]方法配制不同浓度的百香果果皮总黄酮溶液，以抗坏血酸做阳性对照。OH·清除率=[1-(A-A1/A0)]×100%(2)式中：A为样品组吸光值；A0为空白组吸光值；A1为对照组吸光值。1.3.7.2DPPH·清除能力根据文献[27]方法进行试验，以抗坏血酸做阳性对照。DPPH·清除率=[1-(AX-AX0/A0)]×100%(3)式中：AX为反应体系吸光度；AX0为样品本底吸光度；A0为反应体系本底吸光度。1.3.8百香果果皮总黄酮的傅里叶近红外光谱分析取适量经1.3.6纯化的百香果果皮总黄酮粉末与溴化钾混合后压，500~4 000 cm-1范围内扫描[28]。1.4数据统计与分析所有试验重复3次，采用响应面分析软件Design Expert 10.0.3及Origin软件、Excel 2019软件进行数据处理及相关图表绘制。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1液料比对百香果果皮总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，随着液料比不断增大，百香果果皮总黄酮提取率先升高后降低；液料比为50 mL/g时，总黄酮提取率最大，为1.43%。从经济以及节约资源角度考虑，确定最佳液料比为50 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F002图2液料比对百香果果皮总黄酮提取率的影响2.1.2乙醇浓度对百香果果皮总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，百香果果皮总黄酮提取率随乙醇浓度的变化先升高后降低，在乙醇浓度为70%时达到最大。原因可能是醇类溶剂对黄酮类物质的溶解度随乙醇浓度增大而增大，乙醇浓度超过70%时，其他醇溶性杂质的溶解度增加，导致总黄酮提取率被干扰。因此，选择乙醇浓度为70%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F003图3乙醇浓度对百香果果皮总黄酮提取率的影响2.1.3超声功率对百香果果皮总黄酮提取率的影响（见图4）由图4可知，超声功率为220 W时，百香果果皮总黄酮提取率达到最大。过高的超声功率将破坏黄酮分子结构，导致提取率降低，故设定220 W为最适超声功率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F004图4超声功率对百香果果皮总黄酮提取率的影响2.1.4超声时间对百香果果皮总黄酮提取率的影响（见图5）由图5可知，在一定范围内，提取率随超声时间增加而升高，超声25 min时的提取率最大，继续延长超声时间，总黄酮提取率未出现较大程度的下降，表明黄酮可能被提取完全。因此，确定超声时间为25 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F005图5超声时间对百香果果皮总黄酮提取率的影响2.1.5微波时间对百香果果皮总黄酮提取率的影响（见图6）由图6可知，随微波时间延长，总黄酮提取率呈先升后降的趋势。微波时间为3 min时，提取率最高；微波时间超过3 min，黄酮物质的结构因长时间辐射被破坏，导致提取率降低。因此，确定最佳微波时间为3 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F006图6微波时间对百香果果皮总黄酮提取率的影响2.1.6微波功率对百香果果皮总黄酮提取率的影响（见图7）由图7可知，微波功率大于400 W时，功率过大会导致黄酮结构破坏，提取率降低。因此，确定微波功率为400 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F007图7微波功率对百香果果皮总黄酮提取率的影响2.2响应面优化试验2.2.1响应面优化试验结果根据单因素试验结果选取液料比（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）、微波功率（D）进行响应面试验。响应面试验设计及结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.T002表2响应面试验设计及结果试验号ABCD提取率/%101101.76200002.213-10-101.93400-111.74500002.14610-101.707-11001.818100-11.6290-1101.6310-1-1001.591100-1-11.7512001-11.591310011.881400111.9415-100-11.8316-10101.86170-10-11.521800002.171901-101.7120010-11.652101011.78220-1011.80230-1-101.692400002.1525-10011.842611001.632700002.152810101.79291-1001.66通过Design-Expert 10.0.3软件分析试验数据，得二次多项回归方程：y=2.164-0.048 333 3A+0.037 5B+ 0.004 166 67C+0.085D-0.062 5AB+0.04AC+0.062 5AD+0.027 5BC-0.037 5BD+0.09CD-0.177 0A2-0.290 75B2-0.183 25C2-0.202D2。模型显著，具有统计学意义。方差分析结果见表3。模型决定系数R2为0.982 4，模型显著性较高，R2adj=0.964 8，能够解释试验响应值变异的96.48%，接近预测相关系数Pred R2，表明试验模型与实际数据吻合较好。由表3可知，影响提取率所对应的因素顺序为微波功率液料比乙醇浓度超声时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.T003表3方差分析结果因素平方和自由度均方F值P值显著性合计1.05028模型1.030140.07455.740.000 1**A0.02810.02821.240.000 4**B0.01710.01712.790.003 0**C2.083×10-412.083×10-40.160.697 1D0.08710.08765.690.000 1**AB0.01610.01611.840.004 0**AC6.400×10-316.400×10-34.850.044 9*AD0.01610.01611.840.004 0**BC3.025×10-313.025×10-32.290.152 3BD5.625×10-315.625×10-34.260.058 0CD0.03210.03224.550.000 2**A20.20010.200153.960.000 1**B20.55010.550415.450.000 1**C20.22010.220165.030.000 1**D20.26010.260200.530.000 1**残差0.018141.320×10-3失拟项0.015101.536×10-31.970.268 5纯误差3.120×10-347.800×10-4注：“**”表示影响极显著（P0.01），“*”表示影响显著（P0.05）。2.2.2各因素的交互作用分析（见图8~图13）由图8可知，液料比和乙醇浓度交互作用对提取率的影响趋势呈抛物曲面分布，表明二者交互作用对提取率影响显著，提取率随液料比和乙醇浓度的升高均先增后减。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F008图8液料比和乙醇浓度的交互作用对提取率的影响由图9可知，液料比和超声时间交互曲面中，提取率随液料比和超声时间增加先升后降。设置液料比45~55 mL/g，超声时间22~28 min组合为二者影响下提取率的优化提取工艺。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F009图9液料比和超声时间的交互作用对提取率的影响由图10可知，液料比和微波功率增加时提取率均先增后减，且微波功率对提取率的影响较液料比影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F010图10液料比和微波功率的交互作用对提取率的影响由图11可知，提取率随乙醇浓度变化的临界最佳工艺参数约70%，提取率随超声时间变化的临界最佳参数为24~26 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F011图11乙醇浓度和超声时间的交互作用对提取率的影响由图12可知，乙醇浓度和微波功率对提取率的影响呈抛物曲面分布，取乙醇浓度65%~75%、微波功率400~500 W利于提高提取率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F012图12乙醇浓度和微波功率的交互作用对提取率的影响由图13可知，二者交互作用等高线呈现显著的椭圆形，随着超声时间和微波功率的增加，提取率先增后减。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F013图13超声时间和微波功率的交互作用对提取率的影响根据Design-Expert 10.0.3软件运行结果，在液料比、乙醇浓度、超声时间、微波功率的共同影响下，最优提取工艺为液料比48.935 mL/g、乙醇浓度70.655%、超声时间25.271 min、微波功率420.003 W，该条件下模型预测的提取率达到2.176%。2.2.3最优工艺条件试验验证结合实际操作的可行性，取液料比49 mL/g、乙醇浓度71%、超声时间25 min、微波功率420 W条件进行3次重复试验，得到平均提取率为2.25%，与模型预测结果较吻合，表明响应面模型用于分析优化提取率的最佳工艺有效可行。2.3百香果果皮总黄酮抗氧化性试验结果分析（见图14、图15）由图14、图15可知，样品浓度为0.1~0.5 g/L时，百香果果皮总黄酮的抗氧化能力与VC的变化趋势一致，二者对OH·以及DPPH·的清除率随着样品浓度的增加而增加。百香果果皮总黄酮对DPPH·清除率最高达57%，OH·清除率最高达65%，而VC的DPPH·清除率最高可达68%，表明二者均具有较好的抗氧化性，百香果果皮总黄酮的自由基最高清除率均低于VC。质量浓度较低时，百香果果皮总黄酮OH·的清除效果远差于VC；浓度为0.5 g/L时，百香果果皮总黄酮对OH·的清除能力大幅增强，但仍略低于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F014图14百香果果皮总黄酮对OH·的清除效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F015图15百香果果皮总黄酮对DPPH·的清除效果2.4百香果果皮总黄酮红外光谱分析（见图16）由图16可知，样品在3 426.91 cm-1处出现宽而强的吸收峰，为—OH的伸缩振动，表明存在糖上的羟基或酚羟基[29]。在2 927.44 cm-1处较小强度的吸收峰是由于碳氢键的伸缩振动，表明样品含有少量饱和碳上的氢。在1 789.63 cm-1出现的峰源自羰基C=O的伸缩振动，峰属类黄酮，表明百香果果皮中含黄酮类物质。在1 321.02~1 444.43 cm-1间有若干吸收峰，表明存在苯环。由碳—氧单键伸缩振动而引起的较强吸收峰在1 076.09 cm-1出现[30]。在1 344~1 178 cm-1范围内的吸收峰是羟基的弯曲振动，表明有羟基存在。在900~700 cm-1处具有若干吸收峰，表明含有不同位置取代的苯环。提取物中含羟基、羰基、碳氧单键（—C—O—）、不同位置取代的苯环等官能团。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.017.F016图16百香果果皮提取物红外光谱分析３讨论植物黄酮是具有抗氧化、抗菌、抗衰老和抗病毒等特性的天然化学物质[31-32]，在饲粮中添加可提高动物的抗病力和生长性能，改善机体的免疫力[33]。中药黄酮是较好的抗生素替代品[34]，在动物疾病防治方面的应用较广，在动物饲粮中添加可以避免耐药性、药物残留等不良反应[35]。曲根等[36]研究表明，苜蓿草粉和黄酮能够改善断奶仔猪结肠微生物区系的细菌组成及结构，从而提高断奶仔猪的消化代谢能力。本文以百香果果皮为研究对象提取黄酮，对百香果果皮总黄酮的抗氧化性进行研究，结果表明，从百香果果皮中提取的黄酮具有较好的抗氧化活性。４结论本文采用超声-微波辅助提取法对百香果果皮总黄酮进行提取，通过响应面分析得出影响黄酮类化合物提取率的主次因素为微波功率液料比乙醇浓度超声时间。响应面优化得到百香果果皮中总黄酮的最佳提取工艺为液料比49 mL/g、乙醇浓度71%、超声时间25 min、微波功率420 W，平均提取率为2.25%。百香果果皮总黄酮对OH·与DPPH·均具有清除效果，OH·清除率为65%，DPPH·清除率为57%。采用傅里叶近红外光谱对百香果果皮总黄酮提取物进行初步的分析，样品中含有羟基、羰基、不同位置取代的苯环、碳氧单键（—C—O—）等官能团。