玉米秸秆属于常用的青贮原料，碳水化合物含量较高，利于青贮中乳酸菌的大量繁殖[1]。青贮能够提升玉米秸秆淀粉消化率，改善饲喂动物的生产性能[2]。玉米秸秆青贮品质与营养价值能够直接影响动物的生产性能与免疫力等。在玉米秸秆青贮过程中添加化学试剂或酶制剂能够改善玉米秸秆青贮品质，提高青贮营养价值和利用效率[3]。青贮过程使用的酶主要包括纤维素酶、半纤维素酶等，酶类添加剂不会影响青贮饲料的发酵过程，可以降解细胞壁的成分，提高可溶性碳水化合物含量以及消化率[4-5]。纤维素酶（EN）中的氧化还原酶可以消耗氧气，提高青贮环境的厌氧程度，促进乳酸菌的生长繁殖，抑制有害菌繁殖[4]。EN与乳酸菌添加剂常配合使用，可提高青贮饲料的发酵品质和有氧稳定性[6]。本研究在玉米秸秆青贮中添加EN，研究其对青贮饲料品质和营养价值的影响，观察玉米秸秆青贮中添加EN对肉牛生长性能、抗氧化功能、免疫力及养殖经济效益的影响，为EN在青贮饲料喂养肉牛养殖中的进一步使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试验动物青贮原料购自滨州禾跃牧草有限公司，取玉米秸秆切至2~3cm段，为青贮料制作原料；EN为泰安信得利生物工程有限公司生产的粉状酶制剂，酶活为100 000 U/g。试验动物由凤林农场提供，为安格斯牛与本地黄牛杂交F1代，共48头，平均体重约365 kg。1.2试验设计1.2.1玉米秸秆青贮试验设置4组，空白对照组（CK组）添加等量的无菌水；3个试验组分别按照100（EN1组）、200（EN2组）、300 U/g FM（EN3组）配制EN，均匀喷洒在粉碎的玉米秸秆上，充分混合，装入双层聚乙烯青贮袋，真空处理，装入量为1 kg/袋。室温避光保存60 d，开封，取20 g样品，加入180 mL蒸馏水，用于测定发酵品质；剩余样品60 ℃烘干48 h，过40目筛，每组3个重复样，分别称取200 g，装入样品袋，分析青贮品质。1.2.2动物饲养试验选择48头肉牛，随机分为4组，每组12个重复，每个重复1头牛。4组试验牛分别饲喂不同组别青贮玉米秸秆（即CK组、EN1组、EN2组、EN3组）。试验牛均饲喂混合日粮，精粗比4∶6，基础日粮组成及营养水平见表1。预试期7 d，正式试验期60 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平总计100.0玉米秸秆青贮50.0净能/(MJ/kg)6.36玉米20.0粗蛋白/%12.10麸皮8.6粗脂肪/%2.31豆粕8.9中性洗涤纤维/%48.25棉籽粕7.6酸性洗涤纤维/%32.12菜籽粕2.5钙/%0.58石粉0.4磷/%0.29磷酸氢钙0.8食盐0.7肉牛专用复合预混料0.5注：1.肉牛专用复合预混料购自北京科瑞大地生物技术有限公司。2.营养水平均为计算值。1.2.3饲养管理试验阶段，肉牛自由采食与饮水，日常管理、保健、治疗及免疫等程序均按照养殖场现有的规章制度执行。试验过程中以颈枷控制方式进行单槽饲喂，每天7：00对采食量进行统计。1.3青贮品质分析1.3.1青贮感官评价对青贮饲料的气味、结构、色泽进行感官评价，采用德国农业协会（DLG）的饲料评价方法，将总得分分为1级（优良，16~20分）、2级（优良，10~15分）、3级（优良，5~9分）、4级（优良，0~4分），均由专人负责评价。1.3.2青贮品质测定准备用于发酵品质检测的20 g样品匀浆2 min，过滤，采用雷磁PHSJ-4F型pH计测定pH值；苯酚-次氯酸钠比色法检测氨态氮（NH3-N）含量[7]，SHIMADZE-10A型高效液相色谱仪（色谱柱：ShodexRspakKC-811S-DVBgelColumn，30 mm×8 mm；检测器：SPD-M10AVP；流动相：3 mmol高氯酸；流速1 mL/min；柱温：50 ℃；检测波长210 nm；进样量5 μL）测定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验开始前及结束前1 d，试验肉牛禁食12 h称重，每日记录试验肉牛采食量。肉牛试验阶段增重=试验末重-试验初重(1)平均日采食量=试验阶段总采食量/试验天数(2)平均日增重=肉牛试验阶段增重/试验天数(3)料重比=平均日采食量/平均日增重(4)1.4.2血清生化指标试验结束后，所有试验牛颈静脉采血10 mL，25 ℃静置12 h，取血清，置于5 mL离心管，-80 ℃贮存，用于检测血清抗氧化指标和血清免疫指标。1.4.2.1血清抗氧化指标使用ELISA定量试剂盒（上海宝曼生物科技有限公司）测定总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量。1.4.2.2血清免疫指标使用ELISA定量试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）测定免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-2（IL-2）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）和干扰素-γ（INF-γ）。1.4.2.3脂代谢相关指标脂代谢指标包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）及高密度脂蛋白（HDL-C）。TG和TC含量使用酶比色法测定，LDL-C和HDL-C含量使用选择性沉淀法测定。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体操作按照试剂盒说明书进行。1.5数据统计与分析试验数据采用SAS 9.2软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1EN添加剂对玉米秸秆青贮品质影响2.1.1EN添加剂对玉米秸秆青贮感官评价的影响（见表2）由表2可知，添加EN的玉米秸秆青贮感官评定得分均高于CK组，且不同添加量的组间差异较小。未添加EN的玉米秸秆青贮（CK组）茎叶结构较差，呈褐色，有丁酸臭味，视觉与嗅觉评价的评分较低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T002表2EN添加剂对玉米秸秆青贮感官评价的影响项目CK组EN1组EN2组EN2组气味有微弱丁酸臭味（11）无丁酸臭味，芳香果味（13）无丁酸臭味，芳香果味（13）无丁酸臭味，芳香果味（12）结构叶子结构保持较差（2）茎叶结构保持良好（3）茎叶结构保持良好（4）茎叶结构保持良好（4）色泽略有变色呈褐色（1）黄绿色（2）黄绿色（2）黄绿色（2）总分14181918等级2111各EN组玉米秸秆青贮具有清新的果香气，外观良好，无明显变色，结构致密均匀，等级评定均为1级优良。2.1.2EN添加剂对玉米秸秆发酵品质及微生物的影响（见表3）由表3可知，添加EN的玉米秸秆青贮pH值均低于4.2，表明青贮发酵情况较好；随着EN添加量增加，青贮pH值降低，EN2组与EN3组青贮pH值显著低于EN1组（P0.05）。CK组与EN1组青贮乳酸含量显著低于EN2和EN3组（P0.05）。各EN添加组青贮乳酸菌和酵母菌的数量显著低于CK组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T003表3EN添加剂对玉米秸秆青贮品质及微生物的影响项目CK组EN1组EN2组EN2组pH值4.39±0.05a4.15±0.24b3.89±0.14c3.28±0.26c乳酸/%DM2.48±0.21b2.52±0.16b2.72±0.31a2.69±0.11a乙酸/%DM1.68±0.02b2.82±0.24a2.93±0.13a2.90±0.18a丙酸/%DM0.12±0.010.10±0.030.09±0.050.11±0.04丁酸/%DM0.03±0.010.02±0.010.01±0.010.01±0.01氨态氮/(g/kg DM)3.68±0.03a2.79±0.05b2.63±0.12b2.86±0.04b乳酸菌/(lgCFU/g FM)7.95±0.12a7.25±0.15b6.23±0.14c6.18±0.11c酵母菌/(lgCFU/g FM)6.83±0.15a4.45±0.10b3.23±0.08c3.35±0.09c霉菌/(lgCFU/g FM)4.93±0.034.72±0.054.68±0.044.76±0.03注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同2.2玉米秸秆青贮添加EN对肉牛生长性能的影响（见表4）由表4可知，与CK组相比，各EN组肉牛的平均日采食量、平均日增重均显著提高（P0.05），料重比显著降低（P0.05）。EN1组肉牛的末重显著低于EN2组、EN3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T004表4玉米秸秆青贮添加EN对肉牛生长性能的影响项目CK组EN1组EN2组EN3组初重/kg366.78±12.38365.43±13.01366.09±14.83365.49±13.91末重/kg410.98±13.87c424.83±15.83b432.69±15.77a431.29±13.87a平均日采食量/[kg/(只·d)]7.58±0.05b9.23±0.08a9.14±0.03a9.25±0.10a平均日增重/[kg/(只·d)]0.74±0.04b0.99±0.05a1.11±0.17a1.09±0.11a料重比10.24±0.13a9.32±0.10b8.23±0.17c8.48±0.12c2.3玉米秸秆青贮添加EN对肉牛血清生化指标的影响2.3.1玉米秸秆青贮添加EN对肉牛血清抗氧化指标的影响（见表5）由表5可知，EN2组和EN3组肉牛的血清GSH-Px活性显著高于CK组（P0.05）。各组肉牛的血清MDA含量显著低于CK组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T005表5玉米秸秆青贮中添加EN对肉牛血清抗氧化指标的影响项目CK组EN1组EN2组EN3组T-AOC/(U/mL)11.89±1.3012.37±0.9712.88±1.1112.49±1.01GSH-Px/(U/mL)89.23±5.48b92.33±7.28ab95.45±6.17a90.49±5.52aSOD/(U/mL)125.35±6.23110.39±6.10106.48±4.33118.19±4.78CAT/(U/mL)35.17±3.2136.20±3.5235.99±2.7435.78±3.32MDA/(μmol/L)4.52±0.24a4.12±0.25b4.15±0.13b4.24±0.23b2.3.2玉米秸秆青贮添加EN对肉牛血清免疫指标的影响（见表6）由表6可知，与CK组相比，EN1组、EN2组、EN3组肉牛的血清IgG和IgA含量均显著提高（P0.05）。EN2组肉牛的血清IgG含量最高，显著高于EN1组、EN3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T006表6玉米秸秆青贮添加EN对肉牛免疫指标的影响项目CK组EN1组EN2组EN3组IgG/(mg/L)113.59±10.28c124.36±11.34b134.48±10.87a125.48±13.49bIgA/(mg/L)154.33±6.33b174.29±9.08a178.34±8.84a182.42±10.52aIgM/(mg/L)76.43±1.8278.32±3.2676.15±1.7177.25±2.68TNF-α/(ng/L)52.33±1.1253.45±0.8249.99±1.1051.12±1.23IL-1β/(ng/L)19.25±0.3220.65±0.6220.88±0.3319.96±0.53IL-2/(ng/L)305.74±4.87308.15±5.03306.25±5.13305.89±3.56IL-6/(ng/L)99.26±2.23100.13±1.58100.63±2.05101.03±1.32IL-8/(ng/L)256.32±3.14258.14±2.69257.59±3.25256.77±2.66INF-γ/(ng/L)516.74±8.18520.08±10.24519.33±8.65520.16±8.352.3.3玉米秸秆青贮添加EN对肉牛血清脂代谢指标的影响（见表7）由表7可知，各组肉牛的血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.005.T007表7玉米秸秆青贮添加EN对肉牛血清脂代谢指标的影响项目CK组EN1组EN2组EN3组TG0.20±0.600.20±0.350.21±0.050.19±0.29TC3.56±1.483.68±2.153.59±1.643.63±1.94LDL-C3.08±0.232.96±0.133.02±0.683.05±0.59HDL-C1.32±0.121.29±0.321.33±0.281.30±0.27mol/L3讨论3.1EN对玉米秸秆青贮品质的影响青贮饲料品质鉴定过程包括青贮后饲料的感官分析、化学成分分析等[8]。青贮添加剂能够有效改善青贮饲料的色泽、气味和发酵品质[5]。本研究中，EN处理组玉米秸秆青贮的感官分析显著优于CK组。王亚方等[9]比较微生物添加剂、化学添加剂、酶添加剂对全株玉米青贮营养价值、发酵品质的影响发现，酶添加剂处理组全株玉米青贮的综合营养价值高于微生物添加剂处理组和化学添加剂处理组，添加剂组均高于空白对照组。EN中的葡萄糖氧化酶等可消耗氧气，能够促进青贮过程的厌氧环境形成[5]。发酵品质较好的青贮饲料LA含量较高，BA和PA含量较低[10]。pH值是进行青贮饲料品质评价的简单有效的指标，一般pH值下降至4.2认为是稳定青贮[11]。本研究中，EN能够显著影响玉米秸秆青贮的发酵品质，随着EN添加量增加，青贮中乳酸水平显著提高，pH值均低于4.2，与刘辉等[12]、万江春等[13]研究结果一致。青贮酸度提高，厌氧环境有利于乳酸菌的生长繁殖，抑制了酵母菌、霉菌等有害菌繁殖，有助于提高青贮发酵品质。研究表明，酶添加剂可破坏植物细胞壁，降解细胞壁成分，增加青贮饲料的可溶性糖含量，为乳酸菌繁殖提供养分[4]。3.2EN对肉牛生长性能的影响饲喂青贮饲料可提高反刍动物的采食率和日增重等[14-15]。索效军等[16]研究表明，日粮中添加玉米秸秆青贮和全株玉米青贮能够显著提高黑头羊的日采食量，降低料重比。赵亚星等[17]研究发现，青贮饲料能够改善杜寒羊的生长性能和肉品质。本试验中，饲喂添加EN的玉米秸秆青贮能够提高肉牛的平均日采食量和日增重，降低料重比，与孙雪丽等[18]、王改芳等[19]研究结果一致。EN能够提高青贮饲料中干物质和洗涤纤维消化率[9]，进而影响反刍动物干物质采食量[20]。玉米秸秆进行青贮后，纤维含量降低，粗脂肪与粗蛋白含量提高，且气味香甜，提高了玉米秸秆青贮适口性及肉牛的生长性能。3.3纤维素酶对肉牛血清生化指标的影响反刍动物的血清生化指标可从侧面反映肉牛的营养代谢情况[18,21]。SOD属于氧化还原酶，能够水解氧化还原反应中产生的细胞毒性物质，对细胞起保护作用；GSH-Px能够清除过氧化氢，参与谷胱甘肽的运输[22-23]。血清MDA含量升高会刺激血清毒素增加，损伤胃黏膜；GSH-Px能够消除自由基，保护胃壁[24-25]。本研究中，EN添加剂能够降低肉牛的血清MDA含量，提高GSH-Px活性，原因可能是EN减少了肉牛血清细胞内过氧化氢反应，GSH-Px活性增加也会降低血清MDA含量。动物体内球蛋白主要来自机体免疫器官，其含量能够反映动物机体的免疫能力[26-27]。本试验中，EN组肉牛的血清IgG和IgA含量显著高于对照组，与王璐等[28]研究结果一致。卢浩诚等[29]研究表明，日粮添加复合微生态制剂可提高血清IgA、IgG和IgM含量，增强动物抗病力。血清TC和TG与动物脂肪沉积有关，长期饲喂青贮饲料引起TG含量升高[30]，对机体健康产生不利影响[31]。本试验中，EN添加剂含量增加，肉牛的血清TG含量变化不大，表明饲喂添加EN的青贮饲料不影响肉牛健康。4结论本试验中，EN添加剂能够有效改善玉米秸秆青贮品质，提高肉牛生长性能和抗氧化能力，玉米秸秆青贮中EN的最适添加量为200 U/g FM。