大肠杆菌（E. coli）是常见的病原菌，传染性和耐药性较强[1]，能够直接或间接威胁养殖户的经济发展和公共卫生安全[2]。蒲公英是一种重要的中兽医临床常用草药，资源丰富、价格低廉[3]，具有清热解毒、退黄利胆等功效[4]。蒲公英的主要成分为黄酮类和有机酸类物质[5]，具有抗菌、抗病毒和抗癌等[6-8]多种药理活性。采用水提法与醇提法提取咖啡酸的效果差异不明显，水提法具有成本低、操作方便和无毒副作用等优点[9-10]。目前关于蒲公英水提工艺的研究存在咖啡酸含量较低[11]、耗费时间[12]等现象。蒲公英提取液对肠杆菌科的细菌具有体外抑菌作用[13]，可以与痢菌净、阿奇霉素和利福平等抗菌药产生协同作用，对CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠杆菌具有抑制作用[14]。蒲公英复方发酵液能够降低腹泻小鼠腹泻率，维持肠道菌群平衡[15-16]。但关于蒲公英对大肠杆菌引起的小鼠腹泻保护作用的研究较少。本试验通过优化蒲公英水提条件，建立大肠杆菌致BALB/C小鼠腹泻模型，研究蒲公英水提的最优条件及利用体内与体外试验相结合探索提取液对大肠杆菌的抑制作用，为蒲公英的提取及其在兽医临床中的应用提供参考。1材料与方法1.1主要药物与试剂蒲公英全株购自玉林市药材市场，咖啡酸标准品购自中国食品药品检定研究院，甲醇（分析纯）、磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司，谷草转氨酶（AST）试剂盒（微板法）、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（微板法）、谷胱甘肽（GSH）试剂盒（微板法）购自南京建成生物工程研究所。1.2菌株与试验动物大肠杆菌ATCC25922购自中国药品生物制品检定所。50只4~5周龄、体重（18±2）g的健康清洁级雌性BALB/C小鼠购自广州市言诚生物科技有限公司，12 h明暗交替、温度26 ℃、湿度65%的环境中适应性饲养1 w。1.3主要仪器LC-20AT高效液相色谱仪（二极管阵列检测器）购自日本京都岛津公司；酶标仪、全自动高压蒸汽灭菌器、AS3120超声波清洗器，均购自自动科学仪器（天津）有限公司。1.4测定指标及方法1.4.1正交试验设计本试验以提取时间（H）、液料比（R）和提取次数（T）3个条件为主要因素，每个因素设3个水平。L9(34)正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平T/次R/(mL/g)H/h11200.522301.033401.5按照正交设计试验组合筛选最佳提取参数。称取50 g蒲公英药材，浸泡0.5 h，加热回流提取，过滤，合并滤液，浓缩至约50 mL。利用HPLC检测蒲公英提取液中的咖啡酸含量，以确定最佳的提取工艺。1.4.2HPLC分析方法测定蒲公英水提液中咖啡酸含量1.4.2.1色谱条件采用Inertsil ODS-3岛津反相色谱柱（4.6×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-磷酸盐缓冲溶液，比例为2.3∶7.7，流速1.0 mL/min、进样10 μL、柱温40 ℃、检测波长323 nm[17]。1.4.2.2咖啡酸对照品贮备液制备精密称定咖啡酸对照品，利用甲醇溶解制成30 mg/L的咖啡酸对照品贮备液。1.4.2.3供试品溶液制备称取20 g蒲公英药材，采用最优提取工艺提取并收集，过滤，浓缩提取液，吸取2.5 mL置于25 mL容量瓶，纯水定容，使用0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，得供试品溶液。1.4.2.4咖啡酸标准曲线绘制将咖啡酸对照品贮备液稀释为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.10、0.05 g/L，使用0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，在1.4.2.1条件下进行HPLC分析。以咖啡酸对照品浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标y，进行线性回归分析。1.4.2.5专属性验证分别取1份咖啡酸对照品溶液、1份阴性对照、1份供试品溶液，使用0.22 μm的有机系微孔滤膜过滤，在1.4.2.1色谱条件下进行HPLC分析，对色谱图进行对比分析。1.4.2.6精密度验证取1份供试品溶液，在1.4.2.1色谱条件下连续进样6次，进行HPLC分析，测定峰面积，根据结果求出供试品溶液中咖啡酸含量，计算RSD值。1.4.2.7稳定性验证取1份供试品溶液，于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、14、24 h，在1.4.2.1色谱条件下对不同放置时间的同1份供试品溶液进行HPLC检测，测定峰面积，求得各个时间的样品中咖啡酸含量，计算RSD值。1.4.2.8重复性验证使用同1批提取液制备6份供试品溶液，在1.4.2.1条件下进行HPLC检测，测定峰面积，计算供试品中咖啡酸的含量，计算RSD值。1.4.2.9准确度验证精密量取已知含量的供试品溶液0.5 mL，设置6份平行，分别精密加入已知浓度的对照品溶液适量，纯水稀释至25 mL，0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，按1.4.2.1的色谱条件进行HPLC测定，计算咖啡酸含量、回收率。1.5蒲公英水提液抗菌试验1.5.1菌液的制备将大肠杆菌ATCC25922菌种接种于营养肉汤培养基上，37 ℃、180 r/min培养6~8 h，获得大肠杆菌ATCC25922菌悬液。1.5.2蒲公英水提物对ATCC25922最小抑菌浓度（MIC）测定及抑菌曲线试验蒲公英水提物对ATCC25922最小抑菌浓度测定方法参考杨娟[18]和Xu等[19]研究方法。1.5.3蒲公英水提液对大肠杆菌ATCC25922致BALB/C小鼠腹泻的保护作用小鼠随机分为5组，即空白组、模型组和蒲公英低（0.25 g/mL）、中（0.5 g/mL）、高（1.0 g/mL）剂量组，每组10只小鼠。每日记录小鼠体重，连续灌胃10 d（0.2 mL）。除空白组外，其余组小鼠腹腔注射0.2 mL/只的107 CFU/mL菌悬液，观察小鼠精神状态、被毛、腹泻等情况。注射菌液第2 d，小鼠眼球取血后离心分离血清用于检测血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活性和谷胱甘肽（GSH）含量，解剖小鼠，称量肝脏、脾脏、肾脏重量且取脾脏和十二指肠进行H&E染色。1.6数据统计与分析采用GraphPad Prism 8.01统计软件进行统计分析和作图，采用单因素方差方法分析差异显著性。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1蒲公英提取工艺条件优化（见表2、表3）由表2可知，蒲公英中提取咖啡酸的最优组合为T3R1H3，最优提取工艺条件为提取次数3次、液料比为20、提取时间1.5 h，咖啡酸含量为503.06 μg/g。由表3可知，提取次数（T）和提取时间（H）对蒲公英水提液中咖啡酸的提取具有显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T002表2正交试验结果项目TRH咖啡酸含量/(μg/g)1133275.172321279.313313503.064231229.485332361.896223381.487122254.678212347.539111184.50k1238.11345.03231.10k2319.50305.15321.36k3381.42288.85386.57R143.3156.18155.47最优水平T3R1H310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T003表3正交试验分析结果项目平方和自由度均方F值P值校正模型246 754.523641 125.75428.8430.000截距2 865 906.21612 865 906.2162 009.9980.000R8 393.94024 196.9702.9440.076T135 731.369267 865.68547.5970.000H102 629.214251 314.60735.9890.000误差28 516.509201 425.825总计3 141 177.24827校正的总计275 271.03226注：R2=0.896 0，调整R2=0.865 0。2.2蒲公英提取物中咖啡酸的HPLC试验2.2.1专属性验证试验结果（见图1~图3）将准备好的阴性对照（纯水）、咖啡酸阳性对照品溶液和提取液供试品分别使用滤膜（0.22 μm）过滤，在1.4.2.1条件下进行HPLC分析。由图1~图3可知，HPLC方法专属性良好、分离度高，适用于蒲公英水提物中咖啡酸含量的测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F001图1阴性对照品色谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F002图2咖啡酸阳性对照品10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F003图3蒲公英水提物供试品2.2.2线性验证试验结果（见图4）由图4可知，5~100 mg/L范围内，咖啡酸标准曲线回归方程为y=19 257x+33 605，相关系数R²=0.999 3。结果表明，5~100 mg/L范围内，咖啡酸对照品溶液的浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F004图4咖啡酸标准曲线2.2.3稳定性验证试验结果（见表4）由表4可知，24 h内，同1份样品在不同时间测得蒲公英水提液中咖啡酸浓度的平均数为8.6 g/L，RSD值为1.92。结果表明，HPLC方法检测蒲公英提取液中咖啡酸含量稳定性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T004表4稳定性试验结果时间/h咖啡酸浓度/(g/L)咖啡酸浓度均值/(g/L)RSD/%08.848.601.9228.8448.7168.6188.57128.53168.47208.43248.402.2.4精密度验证试验结果（见表5）由表5可知，咖啡酸含量平均数为5.52 g/L，RSD值为1.47%，表明HPLC方法测定蒲公英水提物中咖啡酸含量的方法精密度高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T005表5精密度试验结果编号咖啡酸浓度/(g/L)咖啡酸浓度均值/(g/L)RSD/%15.445.521.4725.5235.5945.6155.4165.562.2.5重复性验证试验结果（见表6）由表6可知，供试品测出咖啡酸含量平均数为5.295 g/L，RSD为1.76%，表明HPLC方法测定蒲公英水提物中咖啡酸含量重复性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T006表6重复性试验结果编号咖啡酸浓度/(g/L)咖啡酸浓度均值/(g/L)RSD/%15.245.2951.7625.2635.3445.1755.4465.322.2.6准确度验证试验结果（见表7）由表7可知，加样回收率试验的平均回收率为98.08%，RSD为1.344%，表明HPLC方法测定蒲公英水提液中咖啡酸含量准确度高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T007表7准确度试验结果编号已知量/mg加入量/mg实测量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%15.295 03.000 08.13798.1098.081.34425.295 03.000 08.01296.5935.295 03.000 08.27899.8045.295 03.000 08.14098.1355.295 03.000 08.01496.6165.295 03.000 08.23299.242.3蒲公英水提液对大肠杆菌ATCC25922体外抑菌试验2.3.1最小抑菌浓度（MIC）试验（见表8）由表8可知，蒲公英水提物的浓度为0.25 g/mL时，对大肠杆菌ATCC25922的生长起完全抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.T008表8MIC试验结果药物浓度/(g/mL)1230.500 00---0.250 00---0.125 00+++0.062 50+++0.031 20+++0.015 60+++0.007 80+++0.003 90+++0.001 95+++0.000 97+++阳性孔+++阴性孔---注：“+”表述有细菌生长，“-”表述无细菌生长。2.3.2抑菌曲线试验结果（见图5）由图5可知，浓度为0.5、1.0、2.0 MIC的蒲公英水提物对大肠杆菌ATCC25922的生长曲线均具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F005图5抑菌曲线试验结果2.4蒲公英水提液对大肠杆菌ATCC25922致小鼠腹泻的保护作用2.4.1BALB/c小鼠脏器系数结果（见图6）由图6可知，模型组小鼠的肝脏指数、脾脏指数数和肾脏指数均显著高于其空白组小鼠（P0.05）；用药后，随着蒲公英水提物浓度增加，小鼠的脏器指数下降，呈药物剂量依赖性。图6BALB/c小鼠脏器指数的影响注：“*”表示差异显著（P0.05）；“**”“***”“****”表示差异极显著（P0.01）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F6a1（a）肝脏指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F6a2（b）脾脏指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F6a3（c）肾脏指数2.4.2十二指肠和脾脏H&E染色切片（见图7、图8）由图7可知，与空白组小鼠相比，模型组小鼠出现十二指肠肠绒毛数量减少、肠绒毛结构被破坏的病理现象，给药组小鼠肠绒毛结构被破坏和数量减少现象均在不同程度上被缓解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F007图7小鼠十二指肠H&E染色切片（200×）由图8可知，与空白组小鼠相比，模型组小鼠脾脏具有明显充血、出血的病理现象，并且随着药物浓度升高，用药组小鼠脾脏充血、出血的病理现象逐步缓解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F008图8小鼠脾脏H&E染色切片（200×）2.4.3小鼠血清AST、ALT活性和GSH含量（见图9）由图9可知，模型组小鼠血清中的AST和ALT活性极显著高于空白组小鼠（P0.01），药物组小鼠血清中的AST和ALT活性相显著低于模型组（P0.05），且呈剂量依赖性；模型组小鼠血清GSH含量显著高于空白组和蒲公英低剂量组（P0.05）。图9小鼠血清中AST、ALT活性和GSH含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F9a1（a）AST活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F9a2（b）ALT活性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.16.018.F9a3（c）GSH含量3讨论本试验蒲公英水煮法提取最佳工艺为提取时间1.5 h、提取次数3次和液料比20 mL/g，水提物中咖啡酸含量为503.06 μg/g。与醇提物相比，水提物作用剂量更低，能够有效降低血清谷草转氨酶活性和肝脏谷胱甘肽含量[20]，具有更广泛的临床应用价值。与梁运霞等[21]水提法相比，本试验提取物中咖啡酸含量更高。体外抑菌试验结果显示，蒲公英水提液对大肠杆菌ATCC25922的MIC为0.25 g/mL，与王小宁等[13]的试验结果一致，高于庞纪伟等[22]和高瑞娟等[23]的试验结果，可能与受试菌株不同或蒲公英提取方法不同有关。蒲公英水提液浓度0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC时，大肠杆菌ATCC25922的正常生长受到一定抑制作用，蒲公英浓度水提液越高，抑制作用越强。体内抗菌试验结果表明，蒲公英水提液能够缓解大肠杆菌ATCC25922引起小鼠的腹泻，减缓小鼠体重的下降，减轻脏器的充血水肿程度，药物组小鼠的脏器指数显著低于模型组小鼠的脏器系数。肠道受到侵袭时，肠绒毛会受损变短，导致绒毛上皮细胞数量减少。大肠杆菌感染使小鼠的肠道屏障受到一定破坏[24]，与本试验十二指肠H&E染色结果一致，模型组小鼠的十二指肠肠绒毛数量明显减少且结构受到极大的破坏，蒲公英水提液低、中和高剂量3个剂量组小鼠肠的绒毛结构逐渐完整，上皮细胞数量逐渐增多。脾脏是机体重要的免疫器官和造血器官，作为血液循环中重要的过滤器官，可以清除血液内的病原体[25]。大肠杆菌刺激会导致脾脏出现充血、出血现象。脾脏H&E染色结果显示，与模型组小鼠相比，蒲公英水提液组小鼠脾脏的充血、出血现象明显缓解。蒲公英水提液可以缓解由大肠杆菌ATCC25922引起的小鼠十二指肠肠绒毛结构破坏和上皮细胞数量减少，减轻脾脏的出血充血等病理变化。血清AST和ALT活性均升高时，表明肝脏受到损伤[26]。本试验中，模型组小鼠的血清AST和ALT活性显著高于空白组小鼠，与模型组相比，蒲公英水提物组小鼠血清AST和ALT活性下降，呈剂量依赖性。GSH能够有效清除体内过量的自由基。大肠杆菌作用后，模型组小鼠血清GSH含量显著高于空白组和蒲公英低剂量组，表明蒲公英水提液具有减轻小鼠腹泻症状及改善肝脏功能的作用。4结论蒲公英咖啡酸最优提取工艺条件为提取时间1.5 h、提取次数3次、液料比20 mL/g，蒲公英水提物体外对大肠杆菌具有良好的抑菌作用，体内对大肠杆菌致小鼠腹泻具有一定的保护作用。