我国农业农村部已全面禁止在饲料中使用促生长抗生素类药物饲料添加剂[1-2]，因此寻找能够替代传统抗生素的物质成为目前的研究热点。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性、较高安全性、独特的作用机制、不易产生耐药性的小分子多肽[3-5]，有望成为传统抗生素的理想替代品之一。菌丝霉素是第一个真菌衍生的防御素，是可能应用于治疗葡萄球菌和链球菌感染的抗生素替代品之一[6]。有研究发现，将菌丝霉素作为猪、鸡、鱼类等畜禽及水生动物饲养过程中的膳食补充剂可有效促进动物生长，降低动物对病原菌的感染发病率，提高机体免疫和抗氧化水平，对稳定肠道微生态平衡有利[7-11]。本研究基于实验室前期已构建产菌丝霉素的重组毕赤酵母菌株4Ple-61，通过对发酵时间、甲醇诱导浓度、发酵体系的pH值进行条件优化，确定菌丝霉素的最佳发酵条件，对4Ple-61菌株发酵液分别以真空冷冻干燥法和喷雾干燥法处理获得含酵母细胞的菌丝霉素制剂，测试其与饲料混合复配的抑菌效果，探究菌丝霉素在饲料替抗中的潜在应用。1材料与方法1.1试验材料产菌丝霉素的重组毕赤酵母菌株4Ple-61为本实验室构建的工程菌；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 26001由中国疾病预防控制中心提供。鱼粉饲料（国产营养饲料鱼饵原料馆）；酵母提取物、蛋白胨购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、甘油、甲醇、氯化钠、购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂粉、酵母氮源基础培养基（YNB）、D-生物素、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白购自北京索莱宝科技有限公司。1.2试验仪器PL203电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、JI80TW高压灭菌锅（厦门致微仪器有限公司）、BCM-1000生物净化台（苏州净化设备有限公司）、SPX生化培养箱（新江南仪器有限公司）、ZQZY-88BE全温振荡培养箱（上海知楚仪器有限公司）、Multiskan FC酶标仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）、SCIENTZ-10N冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、IN-SD-Mini小型喷雾干燥机（安徽英诺工程技术有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1考马斯亮蓝蛋白质标准曲线绘制称量10 mg牛血清白蛋白粉末溶于蒸馏水，100 mL容量瓶定容配制浓度为100 mg/L的标准蛋白溶液，使用蒸馏水稀释为不同浓度的蛋白质溶液，使各浓度终体积为100 μL。加入500 μL考马斯亮蓝G-250溶液，混匀，室温静置5 min，酶标仪测定595 nm的吸光值。以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制蛋白标准曲线。1.3.2培养基配制及发酵时间优化1.3.2.1培养基配制YPD固体培养基：1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂粉，pH值为5.4。BMGY培养基：1%酵母提取物、2%蛋白胨、1% 100 mmol/L磷酸钾缓冲液、1.34% YNB、4×10-7 D-生物素、1%甘油，pH值为6.5。BMMY培养基：1%酵母提取物、2%蛋白胨、1% 100 mmol/L磷酸钾缓冲液、1.34% YNB、4×10-7 D-生物素、1%甲醇，pH值为6.5。固体LB培养基：0.5%酵母提取物、1%蛋白胨、1% NaCl、2%琼脂粉，pH值为7.4。1.3.2.2发酵时间优化将重组毕赤酵母菌株4Ple-61在YPD固体培养基划线活化，30 ℃倒置培养2~3 d，挑取单菌落接入10 mL YPD液体培养基中，30 ℃、220 r/min培养16 h制备种子液。取种子液按10%的接菌量接入BMGY培养基，30 ℃、220 r/min培养至OD600 nm为2.0~6.0。将菌液转移至50 mL离心管中，4 000 ×g离心10 min，超净台内弃上清，使用BMMY培养基将菌体重悬转接至培养基中，每24 h补加1%甲醇[12]。从甲醇诱导开始到诱导144 h，每间隔24 h取样，用于测定细胞湿重、蛋白浓度和抑菌活性，根据菌体生长情况，总分泌蛋白浓度和抑菌效果确定最佳发酵时间。测细胞湿重：取3 mL菌液至离心管，提前称量离心管质量，6 000 ×g离心10 min，充分去除上清，称量，两次质量相减即为菌体质量。Bradford法测蛋白浓度：取500 μL考马斯亮蓝溶液，加100 μL发酵液上清，静置5 min，取200 μL至96孔板，测定595 nm处测吸光度值，根据标准曲线得蛋白浓度。琼脂扩散法测抑菌活性：测试菌S. aureus ATCC 26001用接种环从甘油管中少量蘸取在固体LB平板上划线，37 ℃倒置恒温培养24 h。挑单菌落接入5 mL LB液体培养基，37 ℃、220 r/min培养至OD600 nm约为0.4，取100 μL涂布于LB平板，在平板上用打孔器打孔，每孔中加入100 μL发酵液，4 ℃扩散12 h，37 ℃培养16~18 h，观察抑菌效果。1.3.3甲醇诱导浓度优化参照1.3.2方法，对重组菌株4Ple-61进行诱导发酵，改变方法中甲醇的诱导浓度，每24 h分别按总体系的0.5%、1.0%、1.5%和2.0%补加甲醇，取样测细胞湿重、蛋白浓度和抑菌活性，根据菌体生长情况、总分泌蛋白浓度和抑菌效果确定甲醇的最佳诱导浓度。1.3.4发酵体系pH值优化参照1.3.2方法，对重组菌株4Ple-61进行诱导发酵，通过补加氨水分别控制发酵过程中体系的pH值为5.5、6.0、6.5，每24 h取样测细胞湿重、蛋白浓度和抑菌活性，根据菌体生长情况、总分泌蛋白浓度和抑菌效果确定发酵体系的最佳pH值。1.3.5含酵母细胞菌丝霉素制剂的制备重组菌株4Ple-61发酵液进行真空冷冻干燥和喷雾干燥处理，得到带有酵母细胞的菌丝霉素制剂，进一步提升其附加值。1.3.5.1真空冷冻干燥法收集发酵液于-80 ℃预冻2~3 h，打开冻干机，冷冻降温20~30 min，温度降至-40 ℃以下，放入样品，打开真空泵开关，冻干2 d得粉末。1.3.5.2喷雾干燥法收集发酵液至烧杯中，打开风机，设定进风温度为100 ℃，出风温度为80 ℃，进风风量为80%，进料速度为8%。打开加热器，调节雾化器气压（0.2 MPa），加热器温度达到设定温度时，打开蠕动泵，调节蠕动泵转速，将输料管置于装有发酵液的烧杯，等待物料随着输料管进入雾化器，在出风口处收集干燥的粉末。1.3.6含酵母细胞菌丝霉素制剂在饲料中的初步应用将制备好的含酵母细胞菌丝霉素制剂与鱼粉饲料混合，按照菌丝霉素：鱼粉饲料质量比为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5比例混匀，分别加1 mL蒸馏水制成悬浊液充分混合均匀，便于测定抑菌活性。按1.3.1中琼脂扩散法测定各比例悬浊液对S. aureus ATCC 26001的抑制效果。2结果与分析2.1考马斯亮蓝蛋白标准曲线考马斯亮蓝蛋白标准曲线见图1，得到线性回归方程y=0.004 06x+0.448 32（R2=0.993 04）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F001图1考马斯亮蓝蛋白标准曲线2.2最佳发酵时间的优化结果（见图2、图3）分别在0、24、48、72、96、120、144 h取重组酵母4Ple-61的发酵液。由图2可知，细胞湿重和总分泌蛋白浓度在发酵过程中呈持续上升，在144 h时最高，分别可达92.87 g/L和118.54 mg/L，但在120 h时也分别达到89.92 g/L和115.21 mg/L。因此，120~144 h细胞湿重和总分泌蛋白浓度增长幅度并不大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F002图24Ple-61发酵过程中不同时间的细胞湿重和总分泌蛋白浓度由图3可知，甲醇诱导48 h后即对病原菌S. aureus ATCC 26001具有较明显的抑制效果，48、72、96 h的抑菌活性相差不大，在120 h时抑菌效果显著增加，可能是在此时期内菌丝霉素的分泌大量累积呈现更好的抑制效果，但144 h的抑菌效果与120 h相比相差不大。因此，综合考虑时间等因素，确定120 h为最佳发酵时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F003图34Ple-61发酵过程中不同时间发酵液的抑菌效果注：1~6分别为发酵24、48、72、96、120和144 h发酵液的抑菌效果。2.3最佳甲醇诱导浓度的优化结果（见图4、图5）由图4可知，4Ple-61发酵过程中的细胞湿重和总分泌蛋白浓度均在甲醇诱导浓度为1.0%时达到最高，分别为94.5 g/L和126.02 mg/L，其次是甲醇终浓度1.5%时；甲醇添加量为2.0%时，细胞湿重和总分泌蛋白浓度均最低，表明甲醇过多时会对菌体生长产生抑制作用。图4不同甲醇浓度诱导4Ple-61发酵过程中的细胞湿重和总分泌蛋白浓度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F4a1（a）细胞湿重10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F4a2（b）总分泌蛋白水平由图5可知，甲醇诱导浓度为1.0%和1.5%时抑菌效果相差不大，甲醇诱导浓度为0.5%时的抑菌效果略低于前者，甲醇诱导浓度为2.0%的抑菌圈直径明显减小。结合菌体生长情况，总分泌蛋白浓度和抑菌效果确定甲醇的最佳诱导浓度为1.0%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F005图5不同甲醇浓度诱导4Ple-61发酵120 h的抑菌效果注：1~4分别为甲醇诱导浓度为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%；5为无菌水做对照。2.4最佳发酵pH值的优化结果（见图6、图7）由图6、图7可知，pH值为5.5的培养条件下细胞湿重和总分泌蛋白浓度显著低于pH值为6.0和6.5，但仅在pH值5.5条件下诱导菌丝霉素具有很好的抑菌活性，表明诱导菌丝霉素表达的最适pH值为5.5。但在此pH值条件下，细胞湿重和总分泌蛋白浓度较低，原因可能是此pH值适合用于诱导目的蛋白分泌，但不适合酵母的生长。在甲醇开始诱导时，由于4Ple-61重组酵母菌株在pH值5.5的条件下生长水平很低，初始菌体密度低导致诱导过程中生长缓慢，分泌的总蛋白量少，但在此pH值下又更适合甲醇诱导目的肽生产，即使分泌的总蛋白浓度低，菌丝霉素的含量相较更高，具有良好的抑菌活性。因此，更优的pH值条件为：先控制pH值为6.5使酵母充分生长，当菌体密度达到一定量后，再控制pH值为5.5，开始诱导目的肽分泌，实现更高的生物量和总分泌蛋白浓度及更优的抑菌活性。图6不同pH值条件下4Ple-61发酵过程中的细胞湿重和总分泌蛋白浓度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F6a1（a）细胞湿重10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F6a2（b）总分泌蛋白浓度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F007图7不同pH值条件下4Ple-61发酵120 h抑菌效果2.5含酵母细胞菌丝霉素制剂不同制备方法比较（见表1）由表1可知，由真空冷冻干燥法制备时可高效保持菌丝霉素抑菌活性，损失相对较少，冻干粉末复溶后的抑菌圈直径可达3.32 cm，但进行一次真空冷冻干燥制备时对样品体积有较大限制，不利于实现大批量生产；一个周期需要2~3 d，耗费成本较高，且由于冻干条件影响，有时得到的冻干后样品仍含有一定水分，固形物品质不佳。由喷雾干燥法可得到完全脱除水分的含酵母细胞菌丝霉素制剂，虽有一定损失，但得到固形物品质更好，通过琼脂扩散法测得到固形物复溶后的抑菌圈为3.25 cm，表明抑菌活性基本不受影响；所需周期更短，成本更低，能够实现大批量制备，更适合实际生产。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.T001表1真空冷冻干燥法和喷雾干燥法制备含酵母细胞菌丝霉素制剂比较制备方法制备周期发酵液所得固形物/(g/100 mL)抑菌圈直径/cm真空冷冻干燥法2~3 d5.63.32±0.03喷雾干燥法1~1.5 h/100 mL2.23.25±0.052.6含酵母细胞的菌丝霉素制剂与鱼粉按不同比例复配后的抑菌效果（见图8）由图8可知，按菌丝霉素∶鱼粉为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1比例混合时，对S. aureus ATCC 26001均具有较好的抑制效果，5∶1混合时抑菌圈直径最高为3.25 cm。按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1比例混合时抑菌圈直径相差不大；按1∶1混合时抑菌圈直径仍可达2.76 cm，表明菌丝霉素与鱼粉等质量比混合后即可达到较好的抑制效果。按照1∶2比例混合时，抑菌效果比1∶1混合时明显减弱，抑菌圈直径为1.8 cm，仍具有一定抑制作用；之后随着饲料量降低，抑菌活性逐渐降低，表明含酵母细胞菌丝霉素制剂与饲料原料按合适比例复配后具有很好的抑菌效果，其活性不会降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.015.F008图8含酵母细胞的菌丝霉素制剂与鱼粉按不同比例复配后的抑菌效果3讨论菌丝霉素是一个由40个氨基酸组成的短肽，其在Cys4-Cys30、Cys15-Cys37和Cys19-Cys39之间有3个分子内二硫键，三维结构是典型的半胱氨酸稳定的α螺旋-β片基序，具有良好的抑菌活性和稳定性[13]。菌丝霉素的抑菌机理是通过直接与细菌细胞壁前体物质脂质Ⅱ结合，阻碍其与细胞壁的重要组成部分肽聚糖的结合，从而干扰细胞壁生物合成[14]。由于菌丝霉素独特的抑菌机制对细菌无特异性，不易产生耐药性。通过基因工程异源表达菌丝霉素是目前应用最多的生产策略，具有生产成本低、生产周期短、操作流程相对简单、产量高、生物活性好等优势，主要在大肠杆菌等原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统中实现表达[15-17]。菌丝霉素用于饲料代替抗生素具有很大应用潜力[18]，本研究以毕赤酵母作为宿主表达菌丝霉素，以期实现其在饲料添加中的应用。毕赤酵母作为异源表达宿主表达外源蛋白具有一定优势，发酵过程主要分为菌体生长和诱导目的蛋白表达两个阶段[19-20]。在前一阶段中以甘油作为碳源促进菌体生长，后一阶段以甲醇作为唯一碳源诱导目的蛋白表达，故甲醇的诱导浓度对目的蛋白表达水平具有很大影响。毕赤酵母在发酵过程中采用简单的基础培养基，生长阶段和诱导阶段仅为碳源不同，若要提高目的蛋白的高效表达，对整个发酵过程中各参数的控制至关重要。发酵生产的水平主要取决于菌株自身的遗传特性和发酵过程中的培养条件[21]。本研究对已构建完成的高产菌丝霉素的重组毕赤酵母菌株的发酵条件进行优化，确定了在甲醇诱导浓度为1%、发酵pH值5.5、诱导发酵120 h时，重组菌株4Ple-61菌丝霉素的表达效果最好。饲料中添加菌丝霉素可上调机体免疫因子水平，下调促炎细胞因子水平，还可有效促进先天免疫和体液免疫反应，增强机体抗病毒能力，抑制肠道中的病原菌并强化肠道结构[22-23]。酵母菌水解产物中含有大量的氨基酸、短肽以及丰富的B族维生素等物质，可作为蛋白来源为动物提供营养，增强动物生长性能，是一类天然的绿色生物饲料添加剂[24]。而且酵母菌的生产易于实现工业化、生产周期短、成本较低，可成为一种极具应用潜力的微生物饲料[25-26]。本研究通过喷雾干燥法制备含有酵母细胞菌丝霉素制剂，将其与传统饲料复配后仍可达到良好的抑菌效果，不会对其活性产生影响，还有助于稳定饲料品质，进一步提升其附加值。4结论通过对发酵条件优化，确定了在甲醇诱导浓度为1%、发酵pH值5.5、诱导发酵120 h时，重组毕赤酵母4Ple-61菌株表达菌丝霉素的效果最好。通过比较确定，喷雾干燥法更适合含酵母细胞菌丝霉素制剂的制备。将含酵母细胞菌丝霉素制剂和鱼粉按1∶1复配后具有很好的抑菌效果，表明由重组菌株4Ple-61发酵液制备的含酵母细胞菌丝霉素制剂在饲料替抗中具有一定的应用潜力。