塑料药用滴眼剂瓶是滴眼剂的包装容器[1]，塑料产品为维持其物理、化学特性，加工过程需加入各种助剂。抗氧剂是常用的助剂之一，可延缓和抑制塑料老化。常用的助剂包括受阻酚类抗氧剂BHT、抗氧剂1035、抗氧剂3114、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076和亚磷酸酯类抗氧剂168等[2-4]。研究表明：部分抗氧剂存在毒性，如酚类抗氧化剂具有弱雌激素效应，抗氧剂BHT对肝肾有损害作用，抗氧剂168的主要氧化裂解产物邻苯二甲酸丁二酯，毒理实验表明有致癌作用[5-7]。美国FDA、欧盟EMEA、国家药品监督管理局颁布指导原则，规范塑料包材中添加剂的使用[8-9]。塑料包材与药品长期接触过程中，其中抗氧剂可能迁移至药品，影响药品质量，因此需要对塑料药用滴眼剂瓶中抗氧剂进行考察和控制，以保障药品安全有效[10-12]。欧洲药典(EP)采用高效液相色谱法(HPLC)测定塑料包材中抗氧剂，该方法抗氧剂提取过程较烦琐，需通过回流、过滤、定容等步骤，经多种溶剂处理制得提取液。本实验采用简便的超声萃取技术对样品进行前处理，通过HPLC测定塑料药用滴眼剂瓶中抗氧剂BHT、1035、3114、1010、330、1076、168及其在药品中的迁移，同时开展安全风险评估，并将方法用于实际样品检测。1实验部分1.1主要原料抗氧剂BHT，195055-201901，纯度100%，中国食品药品检定研究院；抗氧剂1035，AL191218-20，纯度100%，美国Stanford Chemicals公司；抗氧剂3114，C10573518，纯度98%、抗氧剂1010，C10271794，纯度94%、抗氧剂330，C10029254，纯度99%、抗氧剂1076，C10497820，纯度98%、抗氧剂168，C11041090，纯度98%，上海麦克林生化科技有限公司；甲苯，色谱纯，永华化学股份有限公司；甲醇，色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司。药包材：低密度聚乙烯药用单剂量滴眼剂瓶（材质LDPE，编号Y1~Y4）、低密度聚乙烯药用滴眼剂瓶（材质LDPE，编号Y5~Y12）、聚丙烯药用滴眼剂瓶（材质PP，编号Y13）、聚酯药用滴眼剂瓶（材质PET，编号Y14~Y20）共20批，涉及12家药包材生产企业。药品：滴眼剂6批，由5家药品生产企业提供，利巴韦林滴眼液，包材编号Y6；萘敏维滴眼液，包材编号Y8；复方托比卡胺滴眼液，包材编号Y12；复方门冬维甘滴眼液，包材编号Y14；四味珍层冰硼滴眼液，包材编号Y15、Y19。将温度为40 ℃，湿度为90%的条件下放置3个月的样品和常温放置的样品用作迁移实验。1.2仪器与设备高效液相色谱仪，LC-20ADXR，配SPD-M20A二级阵列管检测器，日本岛津株式会社；超声波清洗器，KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司；往复振荡器，MMS-3020，东京理化器械株式会社；旋涡混合器，MS3，德国IKA公司；超纯水仪，Elix Essential，德国默克密理博公司。1.3混合标准溶液制备称取7种抗氧剂各0.05 g，分别置于100 mL量瓶，加甲苯使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成500 μg/mL单标溶液，分别量取各单标溶液置于同一量瓶，用甲苯依次稀释成质量浓度为40、20、10、5、2、1 μg/mL线性混合标准溶液。1.4供试品溶液制备1.4.1提取实验溶液取滴眼剂瓶适量，剪碎至0.2 cm×0.2 cm，混匀后取1 g，精密称定，置于具塞三角瓶，加入10 mL甲苯，超声（功率350 W，频率40 kHz）30 min，放冷，甲苯补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。1.4.2迁移实验溶液量取滴眼剂5 mL置于具塞试管，加入2 mL甲苯，涡旋1 min（功率8 W，2 500 r/min）后超声（功率350 W，频率40 kHz）30 min，放冷，甲苯补足减失的质量，摇匀，静置分层，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。1.5仪器色谱条件Shim-pack GIST C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇：水为流动相梯度洗脱，洗脱程序：0~7 min，85%甲醇；7~8 min，85%甲醇~95%甲醇；8~15 min，95%甲醇；15~16 min，95%甲醇~100%甲醇；16~44 min，100%甲醇；44~45 min，100%甲醇~85%甲醇；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：276 nm；进样量10 μL。2结果与讨论2.1流动相选择分别对流动相乙腈、甲醇-水、甲醇、乙腈-甲醇、乙腈-水进行比较，优选甲醇-水、乙腈-水为流动相梯度洗脱，两种流动相对7种抗氧剂均具有较好的分离效果，各抗氧剂色谱峰尖锐且对称，分离度大于1.5。从成本和安全性考虑，甲醇经济、低毒，因此实验选择甲醇-水为流动相。2.2色谱条件选择为达到较好的分离效果及峰形，比较了ZORBAX SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Shim-pack GIST C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、SunFire C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)对7种抗氧剂色谱峰的影响。采用ZORBAX SB-C18和SunFire C8柱时，部分抗氧剂色谱峰有重叠、拖尾现象。采用Shim-pack GIST C18柱，7种抗氧剂色谱峰分离完全且对称，因此选用Shim-pack GIST C18柱。图1为7种抗氧剂高效液相色谱图。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.F001图17种抗氧剂的高效液相色谱图Fig.1HPLC chromatogram of seven antioxidants2.3提取溶剂与提取方式的选择7种抗氧剂均为脂溶性，根据抗氧剂的溶解性能及其与流动相互溶情况，提取溶剂分别选择甲醇、乙腈、甲苯、二氯甲烷，考察加热回流、超声提取（功率350 W，频率40 kHz）的提取效率。图2为不同溶剂在不同提取方式下对抗氧剂的提取效率。从图2可以看出，同一种溶剂，采用回流和超声提取，提取效率没有较大差别。不同的溶剂提取效率比较，极性较大的甲醇、乙腈回流与超声提取，对抗氧剂3114、1010、330、1076、168的提取效率较低，以甲苯为溶剂，对各抗氧剂提取效果最佳。以二氯甲烷为提取溶剂，因其沸点较低，易挥发，导致结果的重复性差。采用回流提取耗时较长，试剂消耗较多，而超声提取适合于批量处理样品，操作快速方便，因此，选择甲苯为溶剂进行超声提取。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.F002图2不同溶剂在不同提取方式下对抗氧剂的提取效率Fig.2Extraction efficiency of antioxidants in different solvents under different extraction methods2.4提取时间的选择以甲苯为提取溶剂，超声10、20、30、40 min；同时以甲苯为迁移实验提取溶剂，涡旋混匀（功率8 W，2 500 r/min）1 min，超声10、20、30、40 min，考察提取实验和迁移实验中不同提取时间下对抗氧剂的提取效率。图3为提取实验中超声时间对抗氧剂提取效率影响。图4为迁移实验中超声时间对抗氧剂提取效率影响。从图3可以看出，随着超声时间的增加，提取实验中各抗氧剂的回收率呈现上升的趋势。当超声时间为30 min，回收率达到最佳。超声时间超过30 min，对抗氧剂的回收率没有明显提高。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.F003图3提取实验中超声时间对抗氧剂提取效率的影响Fig.3Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of antioxidants in the extraction test10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.F004图4迁移实验中超声时间对抗氧剂提取效率的影响Fig.4Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of antioxidants in the migration test从图4可以看出，随着超声时间的增加，迁移实验中各抗氧剂的回收率逐渐上升。当超声时间为30 min，抗氧剂的回收率最高。超声30 min后，抗氧剂的回收率无明显增加。因此，在提取实验和迁移实验中优选的超声提取时间均为30 min。2.5线性关系、检出限与定量下限表1为7种抗氧剂的回归方程、线性范围、相关系数、检出限(LOD)及定量下限(LOQ)。取系列线性混合标准溶液，按最优色谱条件进样分析，以系列线性混合标准溶液中各抗氧剂浓度为横坐标(x，μg/mL)、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。以信噪比3∶1、10∶1，计算LOD与LOQ。从表1可以看出，7种抗氧剂在相应的质量浓度范围内与峰面积呈现良好线性关系。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.T001表17种抗氧剂的回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量下限Tab.1Regression equations， linear range， correlation coefficient（R2）， LODs and LOQs of seven antioxidants序号抗氧剂回归方程线性范围/（μg·mL-1）R2LOD/（μg·mL-1）LOQ/（μg·mL-1）1BHTy=4557.75x-260.011.04~41.680.99990.240.8221035y=2818.94x-78.451.00~40.000.99990.250.8033114y=3269.46x-100.621.08~43.120.99990.240.8141010y=3107.41x-39.401.06~42.320.99990.160.535330y=4521.58x-342.520.99~39.760.99990.150.5461076y=1887.20x-85.611.11~44.480.99990.311.027168y=1682.45x+429.921.05~42.000.99990.301.042.6样品测定提取试验中取20批滴眼剂瓶，按最优色谱条件进样分析，记录峰面积代入回归方程，计算样品中各抗氧剂的含量，表2为提取实验样品测定结果。从表2可以看出，LDPE、PP、PET三种材质滴眼剂瓶中均检出抗氧剂。10批样品中除了抗氧剂1035外，其余6种抗氧剂均被检出，含量3.86~203.54 μg/g，另外10批样品未检出抗氧剂。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.T002表2提取实验样品测定结果（n=2）Tab.2Determine results of the extract test sample（n=2）编号材质抗氧剂BHT抗氧剂3114抗氧剂1010抗氧剂330抗氧剂1076抗氧剂168Y5LDPE11.80—————Y7LDPE——33.91———Y8LDPE———4.01——Y9LDPE——27.27——203.54Y10LDPE————57.44—Y11LDPE————83.40—Y13PP——66.43———Y17PET————7.96—Y18PET—3.86————Y19PET—3.96————注：“—”未检出。μg·g-1μg·g-1迁移实验取常温及加速条件放置3个月的滴眼剂各6批，分别按最优的色谱条件进样分析，所有样品中均未检出抗氧剂。2.7提取实验回收率与重复性取编号Y5滴眼剂瓶适量，剪碎至0.2 cm×0.2 cm，混匀后准确称取1 g，分别加入混合标准溶液2、6、20 μg/mL各10 mL，各浓度样品分别制备3份，考察方法的回收率和重复性。表3为测试结果。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.T003表3提取实验回收率与重复性结果（n=9）Tab.3Extraction assay recovery and repeatability results（n=9）项目抗氧剂种类BHT103531141010加入量/μg20.8462.52208.4020.0060.00200.0021.5664.68215.6021.1663.48211.60测得量/μg31.1671.59197.3619.2058.00187.4919.4158.96187.6118.7758.12189.95平均回收率/%92.4895.4489.0196.0296.6793.7590.0191.1687.0288.7191.5689.77RSD/%1.641.073.084.531.694.802.101.063.083.062.064.08项目抗氧剂种类3301076168加入量/μg19.8859.64198.8022.2466.72222.4021.0063.00210.00测得量/μg20.9357.39186.0719.6961.66194.2621.4759.32186.83平均回收率/%105.2896.2393.5988.5392.4287.35102.2494.1688.97RSD/%3.262.051.674.031.501.574.001.202.80从表3可以看出，7种抗氧剂提取实验回收率为87.02%~105.28%，相对标准偏差(RSD)在1.06%~4.80%，表明该方法具有较好的准确性与重复性。2.8迁移实验回收率与重复性量取包材编号Y19的滴眼剂各5 mL，置于具塞试管，分别加入混合标准溶液2、5、10 μg/mL各2 mL，各浓度样品分别制备3份，考察方法的回收率和重复性，表4为测试结果。从表4可以看出，7种抗氧剂迁移实验回收率在84.79%~104.77%，相对标准偏差(RSD)在1.40%~4.50%，方法准确性与重复性较好。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.T004表4迁移实验回收率与重复性结果（n=9）Tab.4Migration assay recovery and reproducibility results（n=9）项目抗氧剂种类BHT103531141010加入量/μg4.1710.4220.844.0010.0020.004.3110.7821.564.2310.5821.16测得量/μg3.579.4717.973.969.9418.624.409.6819.583.7610.3318.26平均回收率/%85.7390.9186.2499.0099.4393.10101.9689.8090.8288.8597.6186.28RSD/%3.221.901.944.064.474.502.151.402.893.143.952.30项目抗氧剂种类3301076168加入量/μg3.989.9419.884.4511.1222.244.2010.5021.00测得量/μg3.479.4917.394.6611.3521.913.649.5317.81平均回收率/%87.1995.4487.49104.77102.1098.5386.7590.7384.79RSD/%2.682.093.611.702.962.694.002.154.132.9稳定性分析量取测试提取和迁移实验回收率中低质量浓度加标液各一份，分别于室温下放置0、4、8、12、16、20、24 h，按最优色谱条件进样分析。结果表明：提取和迁移实验加标液中7种抗氧剂峰面积RSD(n=7)分别为1.80%~4.02%、2.01%~3.59%，表明两种样品溶液在室温24 h内稳定性良好。2.10安全性评估滴眼剂为高风险给药途径制剂，其质量要求与注射剂类似，按注射途径计算抗氧剂每日允许最大暴露量(PDE)，参考文献[13-15]获得抗氧剂BHT、3114、1010、330、1076、168注射途径PDE。对未知PDE值的抗氧剂1035，按结构相似、毒性相似原则，参考1076的PDE值。滴眼剂中未检出抗氧剂，以方法检出限计算各抗氧剂的每日最大摄入量。每日最大摄入量＝检出限×每日最大剂量，滴眼剂每日最大剂量为0.5 mL。表5为抗氧剂安全评估结果。从表5可以看出，各抗氧剂的每日最大摄入量低于其注射途径PDE值，表明滴眼剂由包材中抗氧剂迁移带来的风险较低。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2022.08.019.T005表5抗氧剂安全评估Tab.5Antioxidant safety assessment抗氧剂PDE注射/（mg·d-1）LOD/（μg·mL-1）每日最大摄入量/10-3 （mg·d-1）BHT1.50.240.1210350.50.250.12311425.00.240.12101015.00.160.083305.00.150.0810760.50.310.161685.00.300.153结论本实验以塑料药用滴眼剂瓶及包装的药品为研究对象，通过优化样品前处理和色谱分析条件，建立了测定塑料药用滴眼剂瓶中7种抗氧剂的含量及其在药品中迁移的高效液相色谱分析方法。利用所建方法对塑料药用滴眼剂瓶及包装药品进行测定，部分滴眼剂瓶检出不同浓度的6种抗氧剂，常温及加速实验的药品中均未检出抗氧剂。以方法检出限对滴眼剂瓶中抗氧剂迁移进行安全性评估，各抗氧剂的每日摄入量均低于PDE值，未产生安全风险。该方法灵敏、简单、准确、可靠，适用于塑料包材中抗氧剂的检测，可以为药包材生产和企业对产品进行质量监控，提高产品质量，降低临床用药风险提供方法参考。