南美白对虾具有适应能力强（适温、适盐范围广等）、生长快等特性[1]。随着南美白对虾养殖量的增加，病害风险也随之增高，如危害性极大的白斑病、急性肝胰腺坏死综合征、桃拉病等，从而影响南美白对虾的养殖经济效益。抗生素可以对上述疾病进行防控，但长期使用抗生素会破坏水体环境，使病原菌产生耐药性，而且药物残留也会危害人体健康[2-3]。因此，需要研发新型病害防治药物。中草药具有高效、低残留、低耐药、低污染等优点[4]。三黄连翘合剂是由黄芩、连翘、大黄和黄药子等中草药按一定配比经水提醇沉所得，其主要成分黄芩苷、连翘苷和大黄素，具有消炎、保肝胆、促生长、抗病原微生物、抗氧化、提高机体免疫力等功效[5-6]，且安全可靠、低毒、副作用小、不易产生耐药性。本课题组前期研究发现，三黄连翘合剂能够通过提高罗非鱼生长性能和机体免疫，减轻海豚链球菌引起的一系列损伤，具有较好的预防效果[7]。目前有关三黄连翘合剂在南美白对虾养殖中的应用研究尚未见报道。本试验通过给予南美白对虾连续饲喂1、3、5、10倍推荐剂量的三黄连翘合剂35 d，探索三黄连翘合剂对南美白对虾血淋巴细胞和生长性能的影响，为三黄连翘合剂在南美白对虾病害防控中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物南美白对虾购自东兴鸿生一龙种苗公司，试验前在试验环境中适应性饲养2周。1.1.2试验药物三黄连翘合剂由黄芩、连翘、大黄和黄药子等中草药按3∶2∶3∶2经水提醇沉配制而成，为广西大学动物科学技术学院兽医药理学实验室研制，广西普大动物保健品有限公司中试生产，产品批号20190520，规格100 mL（相当于原生药50 g），100 mL/瓶，最佳临床推荐剂量为20 mL/kg。1.1.3主要试剂及仪器总胆固醇（T-CHO）、肌酐（CRE）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、甘油三酯（TG）、血清总蛋白（TP）和血清尿素氮（BUN）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Sigma1-14微量高速离心机购自德国Sigma公司；SUNRIS全自动酶标仪购自瑞士TECAN公司。1.2试验设计选取体重（2.0±0.5）g、体长（5.0±1.5）cm健康无特定病原的对虾1 500尾，随机分为5组，每组3个重复，每个重复100尾。对照组对虾投喂基础饵料，4个药物组分别以20、60、100、200 mL/kg剂量，即最佳推荐剂量（20 mL/kg）的1、3、5、10倍分别配制含三黄连翘合剂的南美白对虾饵料，将黏合剂兑水，与三黄连翘合剂充分混匀，与饵料充分拌匀，室温下自然风干，4 °C冰箱保存。试验基础饵料组成及营养水平见表1。试验期35 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.012.T001表1试验基础饵料组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量营养水平合计100.00鱼粉22.00粗蛋白质43.15豆粕20.00粗纤维4.50菜籽粕16.00粗灰分15.26面粉35.00粗脂肪5.50虾壳粉1.00钙3.45鱿鱼膏2.00总磷1.50大豆磷脂油2.00氯化胆碱0.50食盐0.50维生素预混料0.50矿物质预混料0.50注：1.维生素预混料为每千克饵料提供：核黄素45.00 mg、硫胺素25.00 mg、VK 10.00 mg、肌醇200.00 mg、盐酸吡哆醇10.00 mg、VB12 2.00 mg、泛酸钙60.00 mg、生物素1.30 mg、VA 106 666.67 IU、VD 200 000.00 IU、烟酸200.00 mg、叶酸20.00 mg、VE 120.00 IU、VC 16.00 mg。2.矿物质预混料为每千克饵料提供：硫酸锌60.00 mg、氟化钠50.00 mg、氯化钴50.00 mg、氯化钾70.00 mg、碘化钾20.00 mg、磷酸二氢钙80.00 mg、硫酸镁80.00 mg、硫酸锰30.00 mg、硫酸亚铁80.00 mg、氯化钙190.00 mg、硫酸铜50.00 mg。3.营养水平均为计算值。%1.3饲养管理南美白对虾每天投喂4次（8：00、12：00、17：00、21：00投喂），每次投喂对虾总体重2%~3%的饵料，在投喂0.5~1.0 h后将剩料打捞，减少水质污染，根据剩料情况及时调整投喂量，以保证南美白对虾的生长需求，连续投喂35 d。试验期间，定期监控水质，记录试验水体的溶解氧、温度以及pH值的变化。试验期间不断供氧，保证溶解氧不低于6 mg/L，水温在27~29 ℃，pH值为（8.0±0.2），每2 d换一次水，每次换水不超过总水量的1/5，自然光照。1.4测定指标及方法1.4.1临床观察在试验期间，观察和记录南美白对虾的健康情况、临床表现，包括外观体征、行为活动、体重变化、摄食量等，对死亡的对虾及时取肝胰腺，使用Bouin's固定液固定，切片，H.E染色观察。1.4.2生长性能分别于试验前、试验第18、35 d，对虾空腹24 h，每组随机选取50尾对虾称量体长、体重，取18、35 d对虾的肝胰腺称重，计算对虾的体长增长率、体重增重率和肝体比。体长增长率=(末体长-初体长)×100%(1)体重增重率=(末重-初重)/初重×100%(2)肝体比=肝胰腺重/体重×100%(3)1.4.3血淋巴细胞分类计数血淋巴细胞总数（THC）计数：取全血制作血涂片，吉姆萨染色，镜检，计算每200个细胞中各细胞比例，包括透明细胞（HC）、半颗粒细胞（SGC）和颗粒细胞（GC）。1.4.4血清生化指标采血前将1 mL的一次性无菌注射器吸取0.2 mL抗凝剂置于4 ℃冰箱。于南美白对虾第三腹节处采血，每组采取抗凝血30份（≥0.4 mL），使血淋巴与抗凝剂体积比为1∶1，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取上清，-80 ℃保存，测定T-CHO、CRE、TG、ALT、AST、AKP、TP和BUN指标。1.5组织病理观察每组各选取15份完整肝胰腺，Bouin's固定液固定，制作石蜡切片，H.E染色，中性树胶封片，于光学显微镜观察组织病理学变化。1.6数据统计与分析采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，LSD法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1临床表现结果在试验期间，各组南美白对虾整体状态较好，无突发病变和异常死亡。与空白对照组相比，各剂量组南美白对虾精神活动、采食、体色、粪便等均未见异常。2.2三黄连翘合剂对南美白对虾生长性能的影响（见表2）由表2可知，连续给药18 d，与空白对照组相比，1倍剂量组南美白对虾的体长、体重、肝胰腺重、增长率和增重率显著增加（P0.05）；3倍剂量组南美白对虾的体长、增长率显著升高（P0.05）；10倍剂量南美白对虾体长、体重、增长率和增重率显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.012.T002表2三黄连翘合剂对南美白对虾生长性能和脏器指数的影响时间/d组别体长/cm体重/g肝胰腺重/g增长率/%增重率/%肝体比/%0空白对照组5.77±0.311.74±0.28————1倍剂量组5.71±0.201.72±0.17————3倍剂量组5.76±0.191.79±0.20————5倍剂量组5.80±0.291.82±0.20————10倍剂量组5.75±0.231.78±0.18————18空白对照组7.64±0.71b4.26±1.35bc0.24±0.06ab32.73±12.32b146.25±78.14bc5.84±1.491倍剂量组8.38±0.94c5.22±1.82d0.31±0.10c46.72±16.43c203.89±105.74d6.18±1.113倍剂量组8.10±0.95c4.72±1.63cd0.26±0.10b40.48±16.51c163.76±91.33c5.72±1.435倍剂量组7.53±0.90ab3.97±1.51b0.23±0.12ab29.74±15.59ab118.54±83.07ab5.78±1.6910倍剂量组7.18±0.70a3.29±0.96a0.20±0.08a24.91±12.20a85.58±54.19a6.13±1.6935空白对照组9.16±0.41b7.30±1.01b0.41±0.10b19.97±5.41a71.33±23.82a5.64±1.37a1倍剂量组10.33±0.43d9.66±0.67d0.75±0.16d23.33±5.17ab85.01±12.90b7.70±1.32c3倍剂量组10.05±0.56c9.00±1.48c0.62±0.14c24.13±6.90b90.61±31.28b6.93±1.41b5倍剂量组9.28±0.43b7.48±0.92b0.56±0.12c23.32±5.66ab88.30±23.27b7.49±1.08bc10倍剂量组8.66±0.33a5.37±0.75a0.33±0.16a20.57±4.60a63.17±22.74a6.19±1.21a注：1.同列数据同一时间肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.“—”表示无此指标数据。连续给药35 d，与空白对照组相比，1、3倍剂量组南美白对虾的体长、体重、肝胰腺重、增重率和肝体比显著增长（P0.05）；5倍剂量组南美白对虾的肝胰腺重、增重率和肝体比显著增高（P0.05）；10倍剂量组南美白对虾的体长、体重和肝胰腺重显著降低（P0.05）。研究表明，1~5倍剂量的三黄连翘合剂对南美白对虾均具有不同程度的促生长作用。2.3三黄连翘合剂对南美白对虾血淋巴细胞的影响（见表3）由表3可知，连续给药35 d，与空白对照组相比，1、3倍剂量组南美白对虾的THC显著升高（P0.05），HC显著降低（P0.05），5、10倍剂量组南美白对虾的HC比例显著增高，SGC比例显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.012.T003表3三黄连翘合剂对南美白对虾血淋巴细胞的影响时间/d组别THC/(×107/mL)HC/%SGC/%GC/%18空白对照组1.92±0.2211.95±1.0573.14±4.7812.01±2.021倍剂量组1.99±0.1811.65±1.9174.49±4.8911.99±2.143倍剂量组2.01±0.1311.00±1.4274.79±5.3112.18±2.255倍剂量组1.98±0.1811.28±2.2672.14±5.8511.84±2.3410倍剂量组2.02±0.1711.20±1.6273.64±5.6212.15±1.9835空白对照组1.98±0.19b11.65±1.91b72.14±5.85b11.84±2.341倍剂量组2.24±0.28c10.30±1.01a74.44±4.46b12.59±1.783倍剂量组2.27±0.28c10.64±1.05a73.95±3.21b12.51±1.785倍剂量组1.91±0.12ab13.40±1.99c69.24±3.18a11.80±1.6910倍剂量组1.82±0.10a14.15±1.48c68.84±2.77a12.28±1.61研究表明，三黄连翘合剂能够有效提高南美白对虾血淋巴细胞总数，改善血淋巴细胞比例。2.4三黄连翘合剂对南美白对虾血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，连续给药18 d，与对照组相比，1、3倍剂量组南美白对虾血清AKP活性显著升高，10倍剂量组南美白对虾血清AKP活性显著降低（P0.05），3、5、10倍剂量组的南美白对虾血清T-CHO含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.012.T004表4三黄连翘合剂对南美白对虾血清生化指标的影响时间/d组别AKP/(U/mL)ALT/(U/L)AST/(U/L)TP/(mg/L)TG/(mmol/L)CRE/(μmmol/L)BUN/(mmol/L)T-CHO/(mmol/L)18空白对照组7.33±1.97b27.99±9.01121.53±25.8764 697.29±4 207.820.85±0.1469.54±16.049.40±1.531.45±0.31b1倍剂量组11.01±1.80c26.76±5.48117.76±34.1063 556.49±3 670.540.89±0.1774.08±13.229.03±1.831.58±0.39b3倍剂量组10.30±2.52c28.19±8.93116.68±24.5465 907.37±6 911.050.89±0.1975.28±34.289.95±2.941.42±0.30a5倍剂量组7.80±2.78b29.44±7.71127.20±53.4666 826.58±4 573.030.84±0.1274.02±14.639.56±1.740.86±0.27a10倍剂量组5.40±1.64a27.03±9.24137.38±56.3266 682.98±6 623.900.82±0.1662.09±27.5010.92±1.700.85±0.30a35空白对照组10.02±2.47b30.12±6.49ab130.47±23.0967 713.65±2 431.20a0.99±0.21b63.48±17.60c10.87±4.011.44±0.50b1倍剂量组14.03±2.80c28.42±4.61a122.08±27.2072 913.32±5 723.14b0.96±0.23b57.30±10.79bc9.10±1.721.56±0.49b3倍剂量组12.68±0.93c29.05±6.12ab125.64±42.7671 938.77±4 530.12b0.96±0.15b57.92±31.42bc9.51±2.340.96±0.25a5倍剂量组8.15±2.67a30.27±6.33ab130.36±39.8969 714.72±6 901.44ab0.66±0.17a45.01±12.93ab9.76±1.800.99±0.36a10倍剂量组6.76±1.94a32.68±6.20b139.52±41.2367 546.86±3 645.07a0.61±0.11a40.69±19.71a10.21±2.071.09±0.27a连续给药35 d，与空白对照组相比，1、3倍剂量组的南美白对虾血清AKP活性、TP含量显著升高（P0.05）；5和10倍剂量组南美白对虾血清AKP活性、TG、CRE和T-CHO含量显著降低，3倍剂量组南美白对虾血清T-CHO含量显著降低（P0.05）。2.5组织病理学观察结果南美白对虾肝胰腺组织的病理学变化见图1。由图1可知，1、3、5倍剂量组和空白对照组南美白对虾的肝胰腺组织结构清晰、细胞分布均匀、排列有序、细胞完整、胞核饱满。10倍剂量组肝胰腺组织结构基本清晰和完整，但个别区域肝胰腺上皮细胞出现胞浆空泡变性，细胞核皱缩、核仁固缩。研究表明，连续饲喂35 d的 1、3、5倍推荐剂量的三黄连翘合剂对南美白对虾肝胰腺不会造成实质性损伤，具有较好的安全性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.012.F001图1南美白对虾肝胰腺组织的病理学变化（400×）3讨论3.1三黄连翘合剂对南美白对虾生长性能和脏器指数的影响研究表明，大黄素能够显著提高沼虾的增重率；连翘苷可以显著提高大鼠、肉鸡和断奶仔猪的生长性能；黄芩苷在能够明显提高罗非鱼生长性能与饲料转化率[8-10]。但三黄连翘合剂方中成分大黄性味苦寒，大量或长期使用易伤肝脾，降低机体免疫力[11]。本研究中，与空白对照组相比，随着三黄连翘合剂剂量的增加，三黄连翘合剂对南美白对虾的生长性能呈先促进后抑制的效果，1、3倍剂量的三黄连翘合剂能够显著提高南美白对虾体长、体重、增长率和增重率等，10倍剂量三黄连翘合剂能够明显降低南美白对虾的各项生长指标，表明三黄连翘合剂对南美白对虾具有促生长作用，但剂量过高会对南美白对虾的生长起到一定的抑制作用。南美白对虾免疫机能薄弱，不具备完整特异性免疫，主要依靠组织屏障、固有免疫细胞等先天免疫保障机体不受侵害[12]。肝胰腺作为其重要的消化器官和免疫器官，能够分泌多种消化酶和免疫相关酶[13]。脏器指数是评价器官发育完善程度的重要指标，脏器指数越大，机体免疫能力越强[14]。本试验中，随着三黄连翘合剂剂量的增加，试验各组南美白对虾的肝胰腺重量和肝体比呈先升高后降低的趋势，用药时间越久越显著。表明三黄连翘合剂在一定程度上可以促进南美白对虾肝胰腺的生长，从而促进南美白对虾的生长性能和机体免疫功能。3.2三黄连翘合剂对南美白对虾血淋巴细胞的影响淋巴细胞在南美白对虾的免疫中起重要作用，淋巴细胞的数量是衡量其免疫功能的重要指标[15]。南美白对虾的血淋巴细胞可分为SGC、GC和HC。GC和SGC均含有具备吞噬功能的嗜酸性颗粒，与病原的识别、凝固和吞噬作用有关[16]。GC的嗜酸性颗粒更多，功能性更强，胞体积也是3种细胞中最大，SGC与酚氧化酶分泌有关。HC具有血凝作用和部分吞噬作用[17]，但具体功能尚不明确，推断其可能是SGC或GC谱系的未成熟或过早释放的原血细胞[18]。本研究中，连续给药35 d，1、3倍剂量的三黄连翘合剂具有提高南美白对虾的THC数量、降低HC比例的功效；而5、10倍剂量组南美白对虾的HC和SGC比例均有所升高。表明适量的三黄连翘合剂能够有效提高南美白对虾血淋巴细胞数，改善血淋巴细胞比例，从而增强其免疫机能，而过量三黄连翘合剂对南美白对虾血淋巴细胞具有一定影响。3.3三黄连翘合剂对南美白对虾血清生化指标的影响血清生化指标是衡量机体生理和营养状况的重要依据，在机体免疫功能的评价上也具有重要意义。血清中的AKP、ALT、AST、TP、TG、CRE、BUN和T-CHO在机体生长代谢和免疫中具有重要作用。AKP对磷酸基团起调节作用，AKP活性能够直观反映机体在代谢和抗氧化的变化[19]。ALT和AST在血清中含量较少，其在血清中活性能够反映肝细胞受损情况，进一步反映机体代谢功能。TG和T-CHO是中性脂肪的重要组成成分，机体中脂肪代谢情况在一定程度上可通过其在血清中含量衡量。TP是白蛋白和球蛋白的总称，可以直观反映机体的健康、营养情况以及先天免疫功能[20]。CRE和BUN常作为肾功的评价指标，能够反映机体蛋白的代谢情况。本试验中，1、3倍剂量的三黄连翘合剂能够不同程度地提高南美白对虾血清中AKP活性和TP含量；随着三黄连翘合剂剂量的增加，三黄连翘合剂可以不同程度地降低南美白对虾血液中的CRE、TG和T-CHO含量；各剂量的三黄连翘合剂对南美白对虾血清中ALT和AST活性无明显影响，表明三黄连翘合剂对南美白对虾肝细胞无不良作用。3.4三黄连翘合剂对南美白对虾肝胰腺形态学的影响本试验病理组织切片显示，在连续饲喂三黄连翘合剂35 d后，1、3、5倍剂量组肝胰腺病理切片与空白对照组无明显差别，肝胰腺组织结构清晰，细胞分布均匀、排列有序、细胞完整、胞核饱满，无明显实质性损伤；10倍剂量组部分对虾出现肝胰腺细胞空泡变性、胞核皱缩等病理变化。表明1、3、5倍剂量三黄连翘合剂连续饲喂南美白对虾35d对其肝胰腺无实质性损伤，安全性较好。4结论三黄连翘合剂在5倍推荐剂量以内连续饲喂35 d对南美白对虾具有良好的安全性，能够在一定程度上提高南美白对虾的生长性能，改善血清生理生化指标，增强机体免疫功能；10倍推荐剂量对南美白对虾的生长、血清生理生化和肝胰腺具有一定影响。