氧化应激是自由基在机体内大量产生，超出机体清除自由基的能力的一种状态[1]，是造成动物疾病的主要因素[2]。中药具有抗氧化作用。丘富安等[3]研究发现，车前子黄酮能够提高氧化应激鸡血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，降低丙二醛（MDA）含量，在一定程度上提高机体的抗氧化能力。开发利用中药抗氧化剂，可以有效改善畜禽因氧化应激引起的危害[4-6]。刺五加是一种广泛在临床中应用的中药药物[7-8]，富含苷类、多糖、黄酮、木脂素等活性物质[9]，具有抗氧化、抗炎等作用，在动物生产中具有重要作用。Kong等[10]研究发现，在犊牛日粮中添加刺五加粉能够在吮吸期促进胃肠道发育。闫雪等[11]研究发现，刺五加多糖可以提高雏鸡免疫器官指数、T细胞增殖活性、白细胞介素-2（IL-2）水平。Yang等[12]研究表明，刺五加多糖可以抵抗环磷酰胺诱导的鸡免疫抑制疾病，可能成为一种新型的免疫佐剂。黄酮类化合物是刺五加的主要活性成分之一[13]，具有抗氧化功能[14-15]，能够清除自由基，并通过影响体内抗氧化酶活性达到抗氧化的效果。本课题组前期研究发现，刺五加总黄酮能够调节LPS引起的小鼠肠道炎症，改善肠道损伤，调节肠道菌群[16]。本试验研究刺五加茎皮总黄酮的抗氧化能力，以期为刺五加茎皮总黄酮作为饲料添加剂在畜禽业氧化应激中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料刺五加茎皮购自聊城市利民药店；1,1二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三氯乙酸、邻苯三酚、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、2,2'-二氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、三氯化铁、铁氰化钾，均购自sigma-Aldrich上海贸易有限公司；胎牛血清购自四季青生物科技有限公司；胰蛋白酶、DMEM培养基购自美国Gibco公司；CCK-8、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒购自南京建成科技有限公司；SPF鸡胚由聊城市玉凤种禽养殖场提供。1.2主要仪器与设备UV-5900紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、全自动酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）、PE3000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、生物倒置显微镜（奥林巴斯中国有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1刺五加茎皮总黄酮溶液的制备参照文献[17]，在目数为40、乙醇浓度50%、料液比1∶30 g/mL、浸泡时间3 h、提取时间45 min、提取温度65 ℃、超声功率400 W条件下，使用超声波辅助乙醇法提取刺五加茎皮总黄酮。1.3.2刺五加茎皮总黄酮的体外抗氧化活性1.3.2.1还原能力参考文献[18]方法并适当修改，测定刺五加茎皮总黄酮的还原能力，重复3次试验，通过吸光度反映样品还原力，本试验及以下试验均用VC作为对照。1.3.2.2过氧化氢清除率将1 mL VC和样品液（2、4、6、8、10、12 mg/L）加入3 mL H2O2（5 mmol/L），加无水乙醇至10 mL，25 ℃水浴10 min，重复3次，得到平均吸光度，计算清除率。过氧化氢清除率=A1-A2-A0A0×100%(1)式中：A0为对照组（无水乙醇+H2O2吸光度）；A1为试验组（样品+H2O2+无水乙醇吸光度）；A2为背景组（样品+无水乙醇吸光度）。1.3.2.3DPPH自由基清除率参考文献[19]并适当修改，空白对照为无水乙醇，平行测定3次，计算清除率。DPPH自由基清除率=A0-A1-A2A0×100% (2)式中：A0为对照组（无水乙醇+DPPH吸光度）；A1为试验组（样品+DPPH的吸光度）；A2为样品背景组（样品+无水乙醇吸光度）。1.3.2.4超氧阴离子清除率参考文献[20]并适当修改，进行超氧阴离子清除率测定，重复3次试验，求平均值，计算清除率。超氧阴离子自由基清除率=A0-A1-A2A0×100% (3)式中：A0为对照组（无水乙醇+各试剂的吸光度）；A1为试验组（样品+各试剂的吸光度）；A2为背景组[样品+各试剂（无水乙醇替代邻苯三酚）的吸光度]。1.3.2.5ABTS自由基清除率参考文献[21]并适当修改，在734 nm波长，重复3次试验，计算平均吸光度，计算清除率。ABTS自由基清除率=A0-A1-A2A0×100% (4)式中：A0为对照组（无水乙醇+ABTS的吸光度）；A1为试验组（样品+ABTS的吸光度）；A2为背景组（样品+无水乙醇的吸光度）。1.3.2.6羟基自由基清除率参考文献[22]并适当修改，510 nm处测定吸光值，重复3次试验，取平均值，计算清除率。羟基自由基清除率=A0-A1-A2A0×100% (5)式中：A0为对照组（无水乙醇+各试剂的吸光度）；A1为试验组（样品+各试剂的吸光度）；A2为背景组[样品+各试剂（无水乙醇替代水杨酸）的吸光度]。1.3.3刺五加茎皮总黄酮对鸡胚成纤维细胞（CEF）氧化损伤的保护作用试验1.3.3.1刺五加茎皮总黄酮试验溶液的制备配制10 g/L刺五加茎皮总黄酮溶液，DMEM溶液作为溶剂，按试验需要进行稀释。1.3.3.2细胞制备与培养选择发育良好的9~11日龄SPF鸡胚，对鸡胚成纤维细胞进行制备与培养，根据参考文献[23]方法并适当修改，使用DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。1.3.3.3刺五加茎皮总黄酮安全浓度将CEF细胞密度调整至5×104个/mL，接种于96孔板（每孔200 μL），细胞密度达到80%~90%时，弃去上清培养基，PBS清洗，加入200 µL含有不同浓度刺五加茎皮总黄酮（终浓度分别为12、24、36、48、60、72、84、96 mg/L）DMEM培养基，作用24 h，弃上清，加入10%的CCK-8溶液，37 ℃孵育30 min，使用全波长酶标仪检测吸光度（490 nm），计算细胞存活率。空白组使用无血清培养基，每组设6个重复孔。1.3.3.4H2O2诱导CEF细胞氧化损伤模型细胞培养操作方法同1.3.3.3，加入含不同浓度H2O2（0.062 5、0.125 0、0.500 0、1.000 0、2.000 0、4.000 0、8.000 0 mmol/L）无血清DMEM培养基200 µL，分别刺激1、4、24 h，采用CCK-8法计算细胞存活率。空白对照组加入无血清DMEM培养基，每组设6个重复孔。1.3.3.5CEF细胞培养细胞培养操作方法同1.3.3.3，将细胞分为空白组、H2O2组、刺五加茎皮总黄酮低浓度组（24 mg/L）、中浓度组（48 mg/L）、高浓度组（72 mg/L）。药物治疗组给予对应浓度的刺五加茎皮总黄酮，作用24 h，空白组和H2O2组加入无血清DMEM培养基，24 h去除上清培养基，使用PBS清洗，加入含3 mmol/L H2O2无血清DMEM培养基作用1 h，采用CCK-8法计算细胞存活率。1.3.3.6刺五加茎皮总黄酮对抗氧化指标的影响与1.3.3.5中分组及处理方法相同，处理结束后按照细胞裂解说明书裂解细胞，收集上清液，分装冻存于-80 ℃。按照试剂盒说明操作，测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）含量。1.4数据统计与分析数据采用SPSS 21.0的LSD进行显著性分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1刺五加茎皮总黄酮的体外抗氧化活性2.1.1刺五加茎皮总黄酮的总还原能力（见图1）测定还原量以产生的Fe4(Fe[CN]6)为指标，抗氧化剂可以还原铁氰化钾，亚铁离子可以产生普鲁士蓝。吸光度越大代表还原能力越强[24]，Fe4(Fe[CN]6)在700 nm处具有最大吸收峰。由图1可知，随着刺五加茎皮总黄酮浓度的增加，吸光度也增加，表示刺五加茎皮总黄酮还原能力增强，但略低于VC的还原能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F001图1刺五加茎皮总黄酮的总还原能力2.1.2DPPH自由基清除试验结果（见图2）DPPH是评价抗氧化剂强度的方法[25]。由图2可知，在2~20 mg/L的浓度范围内，VC的清除能力均强于刺五加茎皮总黄酮，但刺五加茎皮总黄酮也表现出较强的清除能力，刺五加茎皮总黄酮对DPPH自由基的IC50值为3.9 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F002图2DPPH自由基清除试验结果2.1.3过氧化氢清除试验结果（见图3）由图3可知，刺五加茎皮总黄酮清除过氧化氢的能力与其质量浓度呈正相关，浓度在2~12 mg/L时，VC表现比刺五加茎皮总黄酮更强的清除能力。但在浓度达到8 mg/L时，两者对过氧化氢的清除率非常接近，刺五加茎皮总黄酮清除过氧化氢的IC50值为6.78 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F003图3过氧化氢清除试验结果2.1.4超氧阴离子清除试验结果（见图4）由图4可知，在2~40 mg/L范围内，VC和刺五加茎皮总黄酮均能够清除超氧阴离子，VC清除超氧阴离子能力比刺五加茎皮总黄酮高。刺五加茎皮总黄酮对超氧阴离子的IC50值为32.57 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F004图4超氧阴离子清除试验结果2.1.5ABTS自由基清除试验结果（见图5）由图5可知，在2~12 mg/L浓度范围内，刺五加茎皮总黄酮对ABTS清除能力低于同浓度的VC，ABTS清除率与刺五加茎皮总黄酮的浓度呈正相关。刺五加茎皮总黄酮清除ABTS自由基的IC50值为9.87 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F005图5ABTS自由基清除试验结果2.1.6羟基自由基清除试验结果（见图6）羟基自由基是体内活性最强的氧类，可以很容易地穿过细胞膜，与许多生物分子发生反应[26]，如蛋白质、DNA、脂质等，可导致细胞死亡并诱发各种疾病[27]。由图6可知，在2~12 mg/L时，VC表现高于刺五加茎皮总黄酮的清除羟基自由基能力，但6~12 mg/L时二者清除率开始接近，均对羟基自由基表现出很强的清除能力。刺五加茎皮总黄酮对羟自由基的IC50值为4.88 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F006图6羟基自由基清除试验结果2.2刺五加茎皮总黄酮对CEF细胞氧化损伤的保护作用2.2.1刺五加茎皮总黄酮对CEF细胞的安全浓度测定结果（见图7、表1）由图7（a）可知，CEF细胞正常生长，贴壁均匀；由图7（b）可知，CEF分裂生长情况不正常，细胞贴壁不佳，较少，CEF细胞形态大多为圆形，表示8 mg/L此浓度下对CEF细胞具有抑制作用；由图7（c）可知，在72 mg/L浓度下，细胞形态正常，贴壁密度大，生长良好，对细胞具有一定的保护作用；由图7（d）可知，100 mg/L浓度下，导致细胞视野模糊，无法正常观察细胞。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.F007图7不同浓度的刺五加茎皮总黄酮对CEF形态的影响由表1可知，与空白组相比，随着刺五加茎皮总黄酮浓度的增加，细胞存活率逐渐增加，当浓度达到60 mg/L时，细胞存活率最高，显著高于空白组（P0.05)，当刺五加茎皮总黄酮浓度为84 mg/L时，细胞存活率显著低于空白组（P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.T001表1最大安全浓度测定结果项目空白组12 mg/L24 mg/L36 mg/L48 mg/L60 mg/L72 mg/L84 mg/L96 mg/L细胞存活率100.00±0.0084.71±1.21*102.27±1.74109.91±1.74*111.6±1.65*117.46±1.44*111.92±0.84*83.22±3.22*76.97±2.00*注：与空白组相比，“*”表示差异显著（P0.05）；表2与此同。%因此，72 mg/L是刺五加茎皮总黄酮在CEF细胞上的最大安全浓度，选择24、48、72 mg/L进行后续试验。2.2.2H2O2诱导CEF细胞氧化损伤结果（见表2）由表2可知，H2O2能够刺激CEF细胞，细胞存活率随H2O2浓度的增加而降低。0.062 5~0.250 0 mmol/L H2O2作用24 h时，细胞氧化损伤的程度大于1、4 h，1~8 mmol/L H2O2作用1 h时，细胞氧化损伤程度大于4、24 h；经计算，得作用1、4 h对CEF细胞半数抑制浓度分别为3.051、4.836 mmol/L，最终选择3 mmol/L的H2O2、作用1 h进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.T002表2H2O2诱导CEF细胞氧化损伤结果H2O2浓度/(mmol/L)细胞存活率/%1 h4 h24 h空白组100.00±0.00100.00±0.00100.00±0.000.062 595.51±0.26*95.77±1.03*94.36±1.18*0.125 092.73±1.78*92.62±1.06*90.76±1.65*0.250 091.19±1.78*87.79±2.07*84.93±1.42*0.500 077.61±1.05*74.77±0.93*80.41±2.14*1.000 049.89±2.37*59.67±1.53*66.63±2.56*2.000 037.76±0.68*50.26±2.19*56.96±1.31*4.000 024.05±0.81*44.83±0.93*52.93±2.32*8.000 022.62±1.30*39.60±0.70*48.75±1.75*2.2.3刺五加茎皮总黄酮对H2O2诱导氧化损伤的保护作用（见表3）刺五加茎皮总黄酮（24、48、72 mg/L)作用于CEF细胞24 h后，3 mmol/L的H2O2刺激1 h。由表3可知，与H2O2模型组相比，空白组的细胞存活率显著升高（P0.05），表明H2O2成功诱导CEF细胞氧化损伤。与H2O2模型组相比，VC组和刺五加茎皮总黄酮组的细胞存活率均显著提高（P0.05），表明刺五加茎皮总黄酮能够有效抑制H2O2刺激的CEF细胞氧化损伤，在24~72 mg/L内，呈剂量依赖性。因此，刺五加茎皮总黄酮对H2O2刺激的CEF氧化损伤有很强的保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.T003表3刺五加茎皮总黄酮对CEF细胞氧化损伤保护作用项目空白组模型组VC组刺五加茎皮总黄酮低浓度组刺五加茎皮总黄酮中浓度组刺五加茎皮总黄酮高浓度组细胞存活率100.00±0.00*58.53±2.4494.25±3.14*71.95±2.31*91.46±1.22*98.17±0.61*注：与模型组相比，“*”表示差异显著（P0.05）；下表同。%2.2.4刺五加茎皮总黄酮对CEF细胞抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，模型组CEF细胞中T-AOC、SOD、GSH-Px活性均比空白组有所降低。与模型组相比，刺五加茎皮总黄酮中、高浓度组T-AOC明显提高（P0.05）。SOD活性与刺五加总黄酮浓度呈正相关，各试验组均极显著高于模型组（P0.05）。与模型组相比，VC组和刺五加茎皮总黄酮浓度组的CEF细胞中的GSH-Px活性极显著升高（P0.05），刺五加高浓度组GSH-Px活性高于VC组。当细胞受到H2O2刺激1 h后，与空白组相比，模型组中MDA含量显著升高（P0.05），刺五加茎皮总黄酮组和VC组均可以抑制氧化应激状态下MDA的产生。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.018.T004表4刺五加茎皮总黄酮对CEF细胞抗氧化指标的影响组别T-AOC/(U/mg)SOD/(U/mg)GSH-Px/(U/mg)MDA/(nmol/mg)空白组4.44±0.35*17.79±1.68*27.97±1.08*5.29±0.38*模型组0.62±0.1011.42±0.885.09±0.796.82±0.28VC组5.37±0.09*22.35±1.46*23.35±1.64*4.12±0.43*刺五加茎皮总黄酮低浓度组1.46±0.03*17.68±0.93*16.61±0.32*6.12±0.27刺五加茎皮总黄酮中浓度组2.86±0.21*20.13±1.87*21.13±0.67*5.65±0.26*刺五加茎皮总黄酮高浓度组3.93±0.18*22.23±1.27*29.72±1.73*4.71±0.32*3结论刺五加茎皮总黄酮具有还原能力和清除自由基的能力，对CEF细胞的保护作用呈剂量依赖性，可以通过提高CEF细胞T-AOC、SOD、GSH-Px活性、抑制MDA产生，维持细胞生理活性，增强细胞抗氧化能力。