动物骨骼标本是观察动物体基本结构和形态架构最直接、最简单的施教工具之一[1-3]，且在使用过程中具有不受时间和地点局限的优点。动物骨骼标本的制作一般包括剥皮取肉、脱脂、漂白、拼接、保养等环节。由于骨骼的骨骼腔和骨松质中含有一定的脂肪成分，且脂肪往往存在于骨骼内部或腔隙过小的部位。若处理不当，脂肪便会慢慢溢出，使骨骼发黄、发黑，影响美观，进而缩短骨骼标本的使用寿命。因此，脱脂是骨骼标本制作中至关重要的环节[4]。目前，骨骼标本制作使用的脱脂试剂多为氢氧化钠（NaOH）等碱性试剂，尽管脱脂效果佳，但其具有的腐蚀性对致密程度较低的骨骼破坏性较大[5]。脂肪酶可水解甘油三酯等油性物质，可催化酯水解、酯合成、酯交换等有机反应[6-8]，目前主要应用于皮革等物品的脱脂[9-10]，但关于脂肪酶在骨骼标本制作中脱脂的应用与研究尚未见报道。本研究选取了脂肪酶、氢氧化钠、丙酮、氢氧化钾等4种试剂对家兔骨骼进行脱脂处理，以了解脂肪酶在骨骼标本中的脱脂效果，为骨骼标本的制作提供参考。1材料与方法1.1试验动物选择成年健康家兔4只，购自山东省莱阳市某活鸡店，平均体重约2.5 kg，取下四肢，分别记为1、2、3、4号。1.2试验仪器解剖盘、手术刀、手术剪、电磁炉、铁锅、电子天平等均由青岛农业大学海都学院基础兽医学实验室提供。1.3试验试剂胰蛋白酶（国药集团）、脂肪酶（北京鸿润宝顺生物科技有限公司）、丙酮溶液（青岛农业大学海都学院基础兽医学实验室）、3%过氧化氢溶液成品（山东利尔康医疗科技股份有限公司）、10%氢氧化钾溶液（福州飞净生物科技有限公司）；其他试剂均为国产分析纯试剂。1.4试验方法1.4.1家兔处死家兔提前禁食1 d，为最大程度降低家兔骨骼损伤采用空气栓塞法处死。1.4.2剥皮去肉在避免损伤骨骼的基础上，分离死亡的家兔四肢与躯干。四肢毛皮环切剥下，剔除大块肌肉、组织等附着物。家兔骨骼按照不同兔子的前肢、后肢分组浸泡于胰蛋白酶溶液内，浸泡1~2 d后取出，清水洗净、晾干。其中胰蛋白酶溶液按照胰蛋白酶∶蒸馏水=1∶500的比例配制。1.4.3脱脂4只家兔的四肢依次放入饱和脂肪酶、丙酮、3%氢氧化钠和3%氢氧化钾溶液中进行脱脂。其中饱和脂肪酶置于37 ℃恒温箱中以保持酶的活性，其余试剂在室温下脱脂。记录在相同时间内4种脱脂剂的脱脂效果。于脱脂后的8、16和24 h观察并记录骨骼色泽、洁白度、骨骼松弛度、残留附着度及骨骼表面油脂浸出等情况。待观察记录完毕后将骨骼洗净，晾干。1.4.4漂白使用3%过氧化氢对脱脂后的骨骼进行漂白，浸泡24 h观察并记录骨骼及韧带完整性、颜色和光泽度。漂白完成后，重复清洗2~3次，阴干，观察记录最终漂白效果。1.4.5保存在常温和保持通风的条件下，漂白后的骨骼于阴凉干燥处避光保存150 d后观察期保存效果。2结果与分析2.14种试剂处理家兔骨骼的去肉效果（见图1）由图1可知，胰蛋白酶对于骨骼上的软组织处理效果较好，除少部分难以消化的筋外，骨骼表面肌肉、角质化物质柔软易去，经冲洗后均脱落，骨骼缝隙的细小肉丝也已去除干净。晾干后，骨体表面开始有油脂浸出，呈黄白色交替，且骨股头出现黑色骨髓沉积。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.002.F001图14种试剂处理家兔骨骼的去肉效果Fig.1Meat removal effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones2.24种试剂处理家兔骨骼的脱脂效果（见表1）由表1可知，脂肪酶在24 h脱脂后可达到预期效果，脱脂充分且骨骼未遭到损伤；丙酮在24 h后未达到预期效果，骨骼无损伤但脱脂不充分；3%氢氧化钠溶液和3%氢氧化钾溶液在24 h后脱脂达到预期效果，脱脂充分但骨骼的硬度和质地存在一定损伤。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.002.T001表14种试剂处理家兔骨骼的脱脂效果Tab.1Degreasing effect of four kinds of reagents on rabbit bones时间/h编号效果81骨体硬度正常，骨体泛油较多，附于表面；小型骨微黄，溶液浑浊度变化并不明显2骨体硬度正常，骨体呈部分发白状，泛油较少；小型骨微黄，溶液整体透明干净3骨体硬度正常，骨体泛油较少；小型骨微黄，溶液较浑浊，整体泛白，小试管中出现少量气泡4骨体硬度正常，骨体泛油量增多，骨体油脂逐渐析出，小型骨微黄，溶液较混浊，出现浑浊物，烧杯中有少量气泡产生161骨体硬度正常，骨体颜色略黄，表面泛油区域缩小；溶液棕褐色深度变浅，液体表面存在较多气泡；骨骼表面浮有油脂泡2骨体硬度正常，骨体油脂浸透区减小，骨体表面出现小气泡；液体透明干净3骨体边缘极个别脆软，硬度下降，大型骨骨体颜色变黄；液体浑浊，存在少量絮状物，液体表面浮有油脂泡4骨体边缘极个别脆软，硬度下降，骨体发白仍存在小部分深黄色；溶液较浑浊，液体出现少量颗粒状物，液体表面形成薄油脂层241骨体硬度正常，骨体泛油区域减少，呈黄白色，附着物消失；溶液黄色，液体表面形成大量大块的油脂块，表面形成较厚油脂层，油泡浸润漂浮2骨体硬度正常，微黄；液体底部有少量黄色沉淀，溶液透明干净，液体表面出现较薄油脂层3骨体硬度下降，骨体发黄严重；溶液浑浊，表面产生油脂层夹杂少量细小油脂泡，液体内悬浮大量絮状物4骨体硬度下降，骨体变白；液体底部存在黄色沉淀，溶液较浑浊，表面形成薄油脂层2.34种试剂处理家兔骨骼的漂白效果（见图2、表2）由图2、表2可知，从骨体完整度角度考虑，经脂肪酶、丙酮脱脂后的骨骼再经过氧化氢漂白后，骨体坚硬无损伤；氢氧化钠及氢氧化钾脱脂后的骨骼经漂白后均有不同程度的损伤，如裂隙、硬度下降等。从骨骼颜色角度考虑，经脂肪酶脱脂的骨骼颜色发白，光泽发亮，附着污物少。综合整体考虑，使用脂肪酶脱脂的骨骼经漂白后的骨体完整度和骨骼颜色最优。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.002.F002图2漂白后的家兔骨骼Fig.2Rabbit bones after bleachingXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.002.T002表2家兔骨骼漂白后效果比较Tab.2Comparison of effects of rabbit bones after bleaching编号效果1骨骼完整度高，洁白度高，骨体呈发白发亮的光泽状态，内部骨髓残留较少，硬度正常，无明显裂隙2骨骼完整度高，洁白度较高，骨体颜色稍微发黄，内部骨髓残留较少，硬度正常，无明显裂隙3骨骼完整度下降，存在个别骨块脱落现象；洁白度较低，骨体颜色发黑发暗；内部骨髓残留较多，硬度下降，存在细小裂隙4骨骼完整度下降，存在个别骨块脱落现象；洁白度较高，骨体颜色发白；内部骨髓残留较少，硬度下降，存在极个别细小裂隙2.44种试剂处理家兔骨骼的保存效果（见表3）由表3可知，由于前期脱脂时经过间较短，仍存在部分油脂渗出情况，但脂肪酶在油脂渗出最少的情况下仍保持着骨质完整度高、骨质好、骨骼较白的效果。丙酮虽然达到脱脂目的但完成度不及脂肪酶，且整体泛黄。氢氧化钠和氢氧化钾不仅油脂渗出和脂肪残留较上述两种试剂多，而且腐蚀痕迹严重。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.002.T003表34种试剂处理家兔骨骼的保存效果Tab.3Preservation effect of four kinds of reagents in treating rabbit bones编号效果1骨质完整度高，骨质好，骨骼仍较白，骨骼中段可见少量油脂渗出，两端脱脂效果良好2骨质完整度高，骨质未变化，骨骼整体均有少量油脂渗出，整体有泛黄情况发生3骨骼表面不平整，两端有严重腐蚀痕迹，骨质硬度下降，骨骼中段有油脂渗出，内部可明显看到脂肪残留4骨骼表面不平整，腐蚀痕迹更重，骨质硬度下降，有油脂渗出3讨论3.1试验动物的选取制作骨骼标本前，应注意家兔的年龄和体型。家兔年龄过小、过大或体型瘦弱、发育不良，制作的骨骼易出现形态结构不明显或骨质脆弱的现象，进而导致骨骼标本最后价值受到影响[5]。而家兔体型过于肥胖或年龄过大，附着在骨骼上的脂肪多于正常体型的家兔，将延长骨骼脱脂的时间，加大试剂使用剂量，还提高了脱脂不到位的风险。3.2腐蚀去肉的方法骨骼标本制作方法中，传统的虫噬法、土埋法等制作周期过长且污物残留较难清洗干净[11]，化学试剂腐蚀法多选用氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液虽然可以很大程度地软化水解蛋白质，但经过人工剔除的骨骼大部分骨体裸露，氢氧化钠对骨骼具有一定的直接腐蚀作用。本研究中使用胰蛋白酶进行腐蚀去肉，胰蛋白酶可催化水解碱性氨基酸所形成的肽键，有效去除骨骼附着肌肉及残留物[12]。与传统的虫噬法以及氢氧化钠浸泡法相比，蛋白酶不会对骨骼本身产生不可逆的影响，可最大限度地保留骨骼的完整性，避免了对骨骼的伤害且缩短了制作周期。胰蛋白酶对人的伤害性低[13]，对环境无污染，无需担心废液排入下水道造成污染的问题。3.3不同脱脂剂的本身特性及脱脂效果不同脱脂试剂的选择均以最大程度析出骨体内的油脂成分，且尽可能不损伤骨骼本身为标准。吴坤成等[14]的研究表明，工业环己酮、工业乙酸乙酯、工业丙酮、天那水等试剂具备较好的脱脂效果，但均存在易燃、刺激性强等问题，且工业环己酮为3类致癌物，存在致癌的风险。本研究选用4种脱脂试剂：脂肪酶、丙酮、氢氧化钠、氢氧化钾，在不同的时间段观察其对骨骼的影响，作用效果也不同。有机溶剂丙酮是一种易溶于水且溶解度高的试剂，制作时利用丙酮对脂肪萃取的作用可实现分离骨组织与脂肪的目的[15]。由于丙酮对骨骼自身无影响，经浸泡脱脂后的骨骼完整性、硬度均无较大变化，油脂析出量符合脱脂标准，但丙酮存在刺激性强、气味重的缺点。氢氧化钠与氢氧化钾属于强碱类物质，可与甘油三酯等油脂类物质发生皂化反应，使油脂水解脱出，但易腐蚀骨骼，损伤其完整性。经浸泡脱脂后虽油脂析出量符合标准，但骨骼本身完整度与硬度明显下降。脂肪酶是一种羟基酯水解酶类物质，脂肪酶所具有油-水界面的亲和力，能够在油-水界面上高速率地催化水解不溶于水的脂类物质。本研究表明，脂肪酶具有与丙酮脱脂相似的优点，即浸泡脱脂后的骨骼完整性、硬度均无较大变化，同时脂肪酶还具备丙酮不具备的安全绿色的优点。近年来，也有研究表明，十二烷基苯磺酸钠（C18H29NaO3S，简称LAS）对犬骨骼的脱脂效果良好[4]，是一种高效、低毒环保的优质脱脂剂。但与本研究使用的脂肪酶相比，LAS对皮肤具有一定的刺激性[16]。3.4脱脂试剂安全性分析本研究中选用的丙酮属于有毒且易燃的危险品。在漂白过程中，选择过氧化氢作为漂白剂时，若清洗不到位，残留的漂白剂极易与丙酮发生爆炸反应。氢氧化钠、氢氧化钾均属于强碱类物质，具有强腐蚀性，易对骨骼产生不同程度的影响。因此，碱性试剂的使用的浓度和浸泡时间均要求严格控制。本研究中选用的脂肪酶兼具脱脂效果较好、实惠易得、安全系数高等优点。3.5环境等外界因素对结果的影响本试验时间为冬季，导致溶剂作用时间变缓，且制作溶液时较为不便。此外，溶液的作用效果也受到光照、空气流通等因素的影响。丙酮等试剂极易挥发，影响试验效果。脂肪酶的脱脂程度也会受到温度的影响，在不适的温度下无法最大程度上发挥脂肪酶的脱脂效果。因此，在使用脱脂酶的过程中应注意环境的温度，避免由此导致脱脂的效果不佳。4结论本试验结果表明，脂肪酶脱脂的骨骼经漂白后在骨骼硬度、完整度、洁白度等方面均优于其他脱脂试剂。此外，脂肪酶还具有安全稳定、无污染等特点，是一种安全性、实用性、经济性俱佳的骨骼脱脂剂。