燕麦是禾本科、燕麦属的一年生植物[1]，具有营养丰富和适应性强的特点，主要分布在我国华北、东北和西北的高寒地区[2]。燕麦是一种良好的粮饲兼用型作物，富含粗蛋白和可被消化的纤维素，在饲料生产中发挥重要作用。目前收获的燕麦既可以用于晒制干草，也可制作青贮。由于制作干草的过程易受天气的影响，营养成分损失严重，青贮能够有效保存饲草的状态，又结合了青贮饲料气味酸香、柔软多汁的特点，是一种有效的饲草加工方式[3-4]。青贮是一个微生物厌氧发酵的过程，以乳酸菌为主的微生物利用物料中的营养物质，产生乳酸、丙酸等挥发性有机酸，从而使物料的pH值下降，进而抑制其他腐败微生物的生长，达到长期储藏的目的[5]。青贮过程中微生物活动和化学物质变化构成了一个非常复杂的体系，对整个种群平衡取决于少数优势微生物种群，若改变优势种群则会影响体系的微生物平衡，严重影响青贮饲料的品质。我国对燕麦研究多集中于不同添加剂及添加量对青贮燕麦的发酵品质和营养成分的影响[6-7]，对燕麦青贮发酵过程中微生物多样性变化报道较少。通过对不同时间的燕麦青贮发酵品质、营养成分及微生物多样性进行研究，利于揭示燕麦青贮特性的形成机制，为调控青贮发酵品质提供参考。1材料与方法1.1试验材料燕麦选用草莜1号，2020年种植于内蒙古包头市内蒙古农业大学职业技术学院科技园区。样品在乳熟期全株收割，切短至1~2 cm左右，自然晾晒至水分含量为60%~70%左右进行青贮。按照四分法将青贮原料填入聚乙烯真空包装袋，每袋填充量500 g，采用真空包装机封口，20~25 ℃室温避光保存[8-9]。1.2试验设计试验共设置6个处理组，每个处理设3个重复，分别青贮0、15、30、45、60、90 d，依次命名为FT0、FT15、FT30、FT45、FT60、FT90。按照试验设计青贮天数开袋取样，分析燕麦青贮的发酵品质、营养成分以及微生物多样性。1.3测定指标及方法1.3.1发酵品质的测定取不同处理组的燕麦青贮样品各20 g，加入180 mL蒸馏水充分混匀，静置24 h，组织捣碎机搅拌1 min，大部分草渣用４层纱布滤去，定性滤纸过滤得浸出液。青贮样品pH值采用PHS-3C pH计测定；乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）采用高效液相色谱测定，配紫外检测器和XAqua C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱，流动相A液0.01 mol/mL磷酸氢二铵（pH值2.9）；B液甲醇，流速0.8 mL/min、检测波长210 nm、柱温30 ℃、进样量20 μL[10]；苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH3-N）含量[11]。1.3.2营养成分的测定干物质（DM）采用烘干法测定，取青贮袋中的样品200 g于105 ℃下杀青8 h，65 ℃烘干恒重后称量[12]；粗蛋白（CP）含量采用凯氏定氮法测定[13]；可溶性碳水化合物（WSC）含量采用蒽酮－硫酸比色法测定[14]；NDF（中性洗涤纤维）和ADF（酸性洗涤纤维）含量采用范式（Van Soest）洗涤纤维法测定[15-16]。1.3.3微生物多样性的测定根据FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒要求提取微生物DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，NanoDrop2000测定DNA的浓度和纯度；使用338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增。PCR反应体系（20 μL）：5×FastPfu Buffer 缓冲液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、5 μmol/L上游引物0.8 μL、5 μmol/L下游引物0.8 μL、FastPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL、BSA 0.2 μL、模板DNA 10 ng，加入ddH2O补足。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，72 ℃稳定延伸，共29个循环。完成PCR扩增后，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序[17-19]。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2010和SPSS 20.0软件进行整理、方差分析及相关性分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同发酵时间对青贮燕麦发酵品质的影响（见表1）由表1可知，燕麦青贮随着发酵天数的延长，pH值不断降低；FT90的pH值达到最低，为4.39；FT60、FT90的pH值显著低于其他发酵天数（P0.05）。FT90的LA含量最高，为3.95%，FT60、FT90的LA含量显著高于其他发酵天数（P0.05）。FT90的AA含量最高，为0.88%，显著高于其他发酵天数（P0.05）。FT90的PA含量最高，为0.25%，显著高于其他发酵天数（P0.05）。FT45产生BA，但含量极低。FT45的NH3-N/TN最高，为7.89，且FT30、FT45、FT60、FT90的NH3-N/TN均显著高于FT15（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.023.T001表1不同发酵时间对青贮燕麦发酵品质的影响组别pH值NH3-N/TN/%LA/%DMAA/%DMPA/%DMBA/%DMFT06.33±0.13a1.35±0.09c————FT155.98±0.09b5.80±0.16b1.33±0.09d0.14±0.05e0.11±0.01d—FT305.51±0.10c7.27±0.32a1.85±0.03c0.44±0.05d0.15±0.08c—FT455.07±0.06d7.89±0.28a2.55±0.13b0.57±0.06c0.16±0.02c0.01±0.01bFT604.48±0.07e7.12±0.18a3.85±0.05a0.75±0.11b0.21±0.06b0.04±0.01aFT904.39±0.03e7.52±0.31a3.95±0.10a0.88± 0.09a0.25± 0.07a0.04±0.03a注：1.同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.“—”表示未检出。2.2不同发酵时间对青贮燕麦营养成分的影响（见表2）由表2可知，与FT0相比，FT30、FT45、FT90的DM含量显著降低（P0.05）；FT30、FT45、FT60、FT90的CP含量显著降低（P0.05）；WSC的含量随着发酵天数的延长逐渐降低（P0.05）；FT30、FT45、FT60的NDF含量显著降低（P0.05）；FT30、FT45、FT60、FT90的ADF含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.023.T002表2不同发酵时间对青贮燕麦营养成分的影响组别DM/%CP/%DMWSC/%DMNDF/%DMADF/%DMFT036.82±0.52a11.17±0.39a9.17±0.95a46.04±0.18a32.83±1.45aFT1536.58±0.36ab10.70±0.31ab6.87±0.25b44.48±0.95ab31.30±0.35abFT3035.52±0.94b10.33±0.21b4.62±0.81c42.04±0.16b30.05±1.36bFT4535.31±0.19b9.57±0.17c3.18±0.31d43.44±0.55b29.11±0.67bcFT6035.92±0.26ab9.71±0.44bc2.59±0.47d42.58± 1.01b27.92±0.14cFT9035.71±0.39b9.80±0.19bc2.11±0.46d43.81±2.05ab27.87± 0.74c2.3不同发酵时间对青贮燕麦属水平微生物群落的影响（见图1）由图1可知，不同阶段发酵，微生物群落也存在显著差异。青贮前燕麦原料中主要微生物为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属（Pseudomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）、不动杆菌属（Acinetobacter）、冢村氏菌属（Tsukamurella）等，其中优势均为泛菌属，丰度值为75.37%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.023.F001图1发酵时间对燕麦青贮发酵微生物属水平的影响随着发酵时间延长，发酵15 d时，优势菌为考氏科萨克氏菌（Kosakonia），丰度值为26.36%；乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Enterococcus）开始在发酵中发挥主要作用，丰度值分别为16.19%和15.01%，丰度值大于1%的菌属有肥杆菌属（Hafnia-Obesumbacterium）、魏斯氏菌属（Weissella）、德库菌属（Desemzia）、肉杆菌属（Carnobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus），泛菌属丰度值下降至8.14%。随着青贮时间不断延长，魏斯氏菌属丰度值由第15 d的5.57%增加至30 d的19.89%，之后丰度逐渐降低；肥杆菌属丰度值由发酵第15 d的9.10%增加到发酵30 d的24.68%，再下降至发酵90 d的0.07%；片球菌属（Pediococcus）在青贮30 d达到最大丰度值19.76%。明串珠菌属（Leuconostoc）在发酵45 d时达到最大丰度值17.31%。乳杆菌属从发酵15 d丰度值不断增加，其丰度值在发酵90 d达到82.87%，由于乳杆菌属的不断增加，使乳球菌属和肠球菌属受到抑制，最终成为优势菌群，发酵90 d时丰度大于1%的菌属还有魏斯氏菌属、片球菌属、肠球菌属，丰度值分别为8.26%、4.37%、2.48%。3讨论3.1不同发酵时间对燕麦青贮发酵品质的影响燕麦青贮初期发酵环境中残存的氧气不断耗尽，厌氧菌不断繁殖，乳酸菌的活动使酸性物质不断积累，直接影响了pH值的下降速率[20]。pH值是评价青贮饲料的一个重要指标。本试验中，随着燕麦青贮时间延长，pH值呈下降趋势；青贮过程前60 d，pH值下降趋势快速增加；青贮60 d后，pH值缓慢降低，发酵90 d时的pH值降至4.39。各处理组间pH值差异显著。燕麦青贮前期由于酸性物质浓度不够，腐败微生物活动强烈，随着青贮时间增加，乳酸菌大量繁殖，有机酸含量增加，pH值快速下降。发酵后期，乳酸菌数量趋于稳定，pH值基本下降趋势减缓[21]。NH3-N/TN是衡量青贮饲料中粗蛋白损失率的重要指标。燕麦青贮前30 d的NH3-N/TN快速增长，FT30显著高于FT0，30~45 d内增长趋势减缓，45 d达到最高，之后呈上下波动趋势，青贮90 d比青贮45 d的NH3-N/TN下降了0.37%，FT90的NH3-N/TN为7.52%。青贮过程中产生有机酸是评定青贮品质的重要指标。本研究中，随着青贮时间延长，燕麦青贮的LA和AA含量不断增加，青贮60 d后LA含量增加趋势变缓，FT60与FT90的LA增加量差异不显著，青贮90 d时LA含量3.95%。AA含量随着燕麦青贮时间的延长而显著提高，青贮90 d时AA含量0.88%。LA不断积累可有效抑制腐败菌和霉菌的生长活动，防止青贮饲料变质。AA含量增加，可显著提高青贮的有氧稳定性，延长青贮燕麦的贮藏期。PA是一种霉菌和酵母菌等好氧微生物的抑制剂，可改善青贮饲料微生物结构，在青贮饲料中含量较低。BA对青贮的品质影响较大，不仅会导致青贮料中的蛋白质的分解，还会产生不良气味[22-23]。3.2不同发酵时间对燕麦青贮营养品质的影响DM含量越高，表明饲料潜在利用能源越多。本试验中，燕麦青贮前45 d内，DM含量随着时间延长不断下降，FT45DM含量的损耗率为4.1%。因为在此过程中还存在一定量的腐败微生物，且乳酸菌不断繁殖，其活动需要消耗碳水化合物，导致DM含量持续下降[24]。发酵45 d后，有机酸不断积累，酸性环境抑制了腐败菌进一步繁殖，降低了对DM的损耗，青贮过程趋于稳定，DM含量出现上下波动。青贮90 d，DM含量的损耗率为3.01%。CP是评价饲料的主要指标之一，其含量直接影响青贮饲料的品质。本试验中，燕麦青贮前45 d，CP含量不断下降，FT45的CP含量为9.57%，显著低于FT0；青贮60~90 d，CP含量有所增加，但与FT45差异不显著。这是因为乳酸菌及低pH值有效地抑制了肠杆菌、假单胞菌等腐败菌的生长，降低了蛋白质的分解损失，FT90的CP含量比FT0下降了1.37%。本研究中，青贮前45 d WSC含量随着时间的延长快速下降，FT45的WSC含量显著低于FT0；随着青贮时间延长，微生物数量减少，青贮45 d后WSC含量下降趋势减缓，可能是因为随着青贮的进行，发酵环境中pH值不断降低，抑制了腐败微生物的活动，从而降低了碳水化合物的消耗。但随着乳酸菌数量增加，WSC继续转化为有机酸，发酵后期乳酸菌受到自身产生的酸性过强的乳酸影响，活动进行缓慢[25]，WSC的消耗率减缓，FT45的WSC含量与FT90差异不显著。青贮前后WSC差异显著，FT90的WSC含量为2.11%。NDF是植物细胞壁的主要组成成分，青贮饲料中NDF含量的高低直接影响动物采食量[26]。本试验中，燕麦青贮NDF含量有所降低，但差异不显著。随着青贮时间延长，NDF含量在一定范围内上下波动，FT90的NDF含量比青贮前下降2.23%。ADF是反刍动物难以消化吸收的物质，随着燕麦青贮时间的延长，ADF含量不断降低，FT45显著低于FT0，之后趋于稳定。3.3不同发酵时间对青贮燕麦属水平微生物群落的影响乳酸菌在青贮过程中起到至关重要的作用，直接影响青贮饲料的品质。燕麦青贮过程中，微生物群落结构呈下降趋势，青贮原料中以泛菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属等为优势微生物，在生长繁殖过程中消耗大量的营养物质。燕麦青贮前期，乳球菌属、肠球菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、明串珠菌属等发挥主要作用，LA、AA等酸性物质不断增加，pH值快速下降；肥杆菌属、假单胞菌属等其他微生物受到抑制，而乳杆菌属在发酵后期迅速繁殖，最终成为优势菌属。乳酸菌的生长繁殖抑制了肠杆菌属和霉菌的生长，不同青贮阶段乳酸菌的丰度值也不相同，故燕麦青贮可采用混合乳酸菌添加剂提高青贮品质。陆永祥等[27]研究发现，不同海拔的燕麦青贮中细菌群落组成发生了显著的变化，乳酸菌属相对丰度随着海拔升高而逐渐提高，有害菌（如梭状芽孢杆菌）属相对丰度显著降低。使用布氏乳杆菌和甲酸处理的燕麦青贮，乳酸菌的相对丰度显著提高[28]。上述研究结果与本研究结果类似，表明燕麦在青贮后有益菌群的相对丰度显著提高。4结论本研究结果表明，随着燕麦青贮天数延长，pH值逐渐降低，LA含量逐渐升高，NDF和ADF含量显著降低，乳酸杆菌属成为优势菌群。综合各项数据指标，燕麦适宜的青贮天数为60~90 d。