碧根果又名山核桃。山核桃青皮是外部未成熟的外果皮，含有多酚、黄酮、多糖、胡桃醌等，具有抑菌、清热解毒、治疗皮肤病、抗癌等功效[1-2]。生产过程中山核桃青皮大多作为废弃物丢弃，其价值未得到有效开发利用，造成了资源浪费及一定程度的环境污染。植物多酚具有多种生物学功能，如抗氧化、抗衰老、防辐射和预防心血管疾病等[3]。Selani等[4]研究表明，储藏9个月后，添加葡萄皮多酚均能够有效抑制生鸡肉、熟鸡肉冷冻时期的脂质氧化作用。孙承峰等[5]报道，苹果多酚能够抑制猪肉氧化作用。植物多酚主要的提取方法有微波提取法、热水浸提法、超声-微波协同萃取法和微波法等[6-7]。其中超声辅助提取具有节能、安全和工艺简单和多酚损失少等优点[2]。王君等[8]采用超辅助提取金丝皇菊多糖，在最优提取条件下得到的多糖具有较好的抗氧化活性。沈碧寒等[9]利用响应面法优化核桃青皮多酚提取工艺，结果表明，在提取时间47 min、料液比1∶32 g/mL和乙醇体积32%条件下，多酚提取率为33.18 g GAE/kg。高磊等[2]利用微波辅助提取核桃青皮中多酚，结果表明，在微波功率200 W、料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数65%、微波时间70 min、提取温度60 ℃条件下，多酚提取量为6.318 mg/g。在实际生产加工过程中，碧根果中的青皮多酚与碧根果蛋白结合造成蛋白沉淀，故生产中需要去除碧根果中的青皮多酚。但碧根果中的青皮多酚具有较高的功效作用，本研究采用响应面方法对碧根果青皮多酚进行优化制备，通过体外模拟口腔、胃肠消化吸收探究碧根果多酚的抗氧化活性，为开发碧根果青皮多酚健康食品及其在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料碧根果（市售）。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、无水碳酸钠、无水乙醇（上海源叶生物科技有限公司）；盐酸（厦门盛朗赛创生物科技有限公司）、邻菲罗啉（中天精细化工有限公司）。上述试剂均为分析纯。1.2试验仪器YH-640DH超声波振荡仪（无锡市苏胜电泳设备工程有限公司）、KHW-D-2电热恒温水浴锅（常州恒隆仪器有限公司）、离心机（苏州盛天力离心机制造有限公司）、电子天平（上海精科天美科学仪器）。1.3测定指标及方法1.3.1样品处理碧根果青皮洗净，37 ℃烘干，研磨粉碎，粉碎后的干燥样品，过60目筛，添加一定量的无水乙醇溶液，混匀，于超声仪器中进行超声处理，5 000 r/min离心5 min，收集上清液冻干称重。1.3.2碧根果青皮多酚得率多酚得率=m1/m×100%(1)式中：m1为碧根果青皮多酚干重；m为碧根果青皮干重。1.3.3超声法提取碧根果青皮多酚单因素试验准确称取50~80 g碧根果青皮，分别考察单因素液料比（5、10、15、20、25 mL/g）、乙醇体积分数（10、30、50、70、90%）、超声温度（20、30、40、50、60 ℃）和超声时间（20、30、40、50、60 min）对碧根果青皮多酚得率的影响。1.3.4响应面Box-Benhnken试验设计在单因素的基础上以碧根果青皮多酚得率为响应值Y，采用响应面Box-Benhnken软件对碧根果青皮多酚进行优化分析，响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.T001表1响应面因素水平设计水平X1液料比/(mL/g)X2乙醇体积分数/%X3超声时间/minX4超声温度/℃1103030402155040503207050601.3.5体外模拟胃肠液抗氧化活性研究1.3.5.1体外模拟消化液的制备口腔唾液：邀请5~7名试验人员，清水漱口，每人收集10 mL唾液，静置20 min，2 000 r/min离心5 min，取上清液于-20 ℃保存[10]。胃液配制：准确称取0.5 g胃蛋白酶，加入少量去离子水浸湿，加入15 mL 0.5mol/L蒸馏水，旋涡振荡，加入80 mL去离子水，1 mol/L磷酸盐缓冲液调pH值至1.3，定容至100 mL，4 ℃冰箱保存[10]。肠液配制：配置1 mol/L磷酸二氢钾溶液调节pH值至7.0，定容至80 mL，混匀，加入0.5 g胰蛋白酶再次振荡，充分混匀，定容至100 mL，4 ℃冰箱保存[10]。1.3.5.2体外模拟消化系统方法模拟口腔消化试验：准确吸取4 mL 2.0 g/L样品待测液和4 mL唾液于试管，混匀，37 ℃恒温水浴锅中分别消化5、10、15、20和30 min灭酶，5 000 r/min离心5 min，取上清液于-20 ℃保存[10]。模拟胃液消化试验：准确量取1 mL配制的胃液与1 mL消化10 min的口腔唾液混合，使用1 mol/L磷酸盐缓冲液调pH值至7.0，于37 °C恒温水浴锅中分别消化5、10、15 min以及1、2和3 h后灭酶，冷却，5 000 r/min离心5 min，取上清液于-20 ℃保存[11]。模拟肠液消化试验：准确吸取1 mL胃液消化液加入3 mL模拟肠液，调节pH值至5.5，于37 ℃恒温水浴锅中分别消化5、20 min以及1、2、4和6 h后灭酶，冷却，5 000 r/min离心5 min，取上清液于-20 ℃保存[12]。1.3.5.3碧根果青皮的抗氧化活性研究（1）DPPH·清除能力。参照Kao等[13]方法，将DPPH和乙醇溶液配制为0.25 mmol/L DPPH-乙醇溶液，取2.5 mL该溶液与0.5 mL 2 g/L青皮多酚溶液充分混合，于阴暗干燥处反应20 min，517 nm处测吸光度，计算清除率。DPPH·清除率=(M1-M)/M×100%(2)式中：M1和M分别为样品和空白对照（蒸馏水）的吸光值。（2）OH·清除能力。参照Zhu等[14]方法，准确吸取0.5 mL 2 g/L青皮多酚溶液，依次加入2 mL的10 mmol/L H2O2、1.5 mL 2 mmol/L邻菲罗啉和1.5 mL的2 mmol/L硫酸亚铁，边添加边振荡，混匀，调节pH值至7.0，于阴暗干燥处反应30 min，536 nm处测吸光度值，计算清除率。OH·清除率=(M2-M)/(M1-M)×100%(3)式中：M2、M1和M分别碧根果样品组、对照组吸光值和空白组的吸光度值。（3）·O2-清除能力。将Tris-HCl配置成50 mmol/L、pH值8.0缓冲溶液，准确量取4.5 mL缓冲溶液于试管中，置于恒温水浴锅（25 ℃）中孵育25 min，依次添加2 mL碧根果多酚溶液和0.5 mL邻苯三酚溶液（由25、8 mmol/L HCl配制而成），混匀，测定吸光值，每1 min记录1次OD值（325 nm），记录至5 min停止。8 mmol/L HCl 代替邻苯三酚溶液，蒸馏水代替样液作为自氧化管[15]。计算·O2-清除能力。氧化速率=(D1-D2)/T(4)·O2-氧化速率=(V1-V2)/V1×100%(5)式中：D1和D2为样品5、0 min记录的吸光度值；V1和V2为自氧化管和样品管的氧化速率；T=4 min。1.4数据统计与分析试验数据采用Designexpert 8.0软件分析绘制，SPSS 11.5统计软件进行方差分析。所有试验均重复3次，取平均值，结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1超声法提取碧根果青皮多酚单因素试验结果2.1.1液料比对碧根果青皮多酚得率的影响（见图1）由图1可知，碧根果青皮多酚得率随液料比增大呈先上升而后缓慢降低的趋势，当液料比为15 mL/g时，碧根果青皮多酚得率最高，可达7.89 mg/g，是因为适当的液料比利于多酚溶出。继续增大液料比使青皮多酚得率呈缓慢下降趋势，可能由于青皮多酚在液料比为15 mL/g时达到了平衡状态[16]。因此，选择液料比15 mL/g左右为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F001图1液料比对碧根果青皮多酚得率的影响2.1.2乙醇体积分数对碧根果青皮多酚得率的影响（见图2）由图2可知，当乙醇体积在50%时，碧根果青皮多酚得率最高，可达8.01 mg/g。继续增大乙醇体积分数，碧根果多酚得率开始下降，可能是由于有机溶剂会破坏多酚与蛋白质、多糖等物质间的氢键和疏水相互作用[17]。因此，乙醇体积分数选择在50%左右为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F002图2乙醇体积分数对碧根果青皮多酚得率的影响2.1.3超声时间对碧根果青皮多酚得率的影响（见图3）由图3可知，在超声时间试验范围内，碧根果青皮多酚得率整体呈先上升后下降的趋势，且在超声时间为40 min时，碧根果青皮多酚得率逐渐增加至8.86 mg/g，可能是在超声时间为40 min时可使碧根果青皮多酚尽可能溶出。随超声时间延长，碧根果青皮多酚呈下降趋势，可能是因为超声时间延长，碧根果青皮多酚被氧化或是超声时间过长破坏了碧根果青皮多酚的结构，使有效碧根果青皮多酚含量下降[18]。因此，超声时间选择40 min左右为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F003图3超声时间对碧根果青皮多酚得率的影响2.1.4超声温度对碧根果青皮多酚得率的影响（见图4）由图4可知，在超声温度20~60 ℃范围内，碧根果青皮多酚得率整体呈先上升后下降的趋势，且在超声温度为50 ℃时，碧根果青皮多酚得率最高，可达7.77 mg/g，可能是因为适当温度可使碧根果青皮多酚尽可能溶出。继续升高温度至60 ℃时，碧根果青皮多酚开始下降，可能是因为碧根果青皮多酚的热稳定性较差，在超声过程中导致一部分多酚氧化，使溶出的青皮多酚含量下降[19]。因此，超声温度选择50 ℃左右为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F004图4超声温度对碧根果青皮多酚得率的影响2.2响应面优化碧根果青皮多酚提取工艺2.2.1线性回归模型方差分析（见表2、表3）以液料比、乙醇体积分数、超声时间和超声温度为自变量，响应值Y为碧根果青皮多酚得率，采用Design-Expert 8.0软件进行29组优化试验的分析，对试验结果进行线性回归拟合，得到线性回归方程为：Y=8.60+0.35X1+0.98X2+0.24X3+1.45X4+1.50X1X2+0.043X1X3+0.16X1X4-0.33X2X3+0.49X2X4+0.14X3X4-1.38X12-1.43X22-0.72X32-2.18X42。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.T002表2响应面组合试验设计与结果试验号X1/(mL/g)X2/%X3/minX4/℃Y多酚得率/%1105050506.42±0.212107040504.21±0.323157040608.34±0.304207040508.88±0.335155040508.96±0.426205050506.86±0.227157050507.34±0.198205040606.61±0.219105030505.43±0.2210105040403.96±0.2211103040506.10±0.3112153040402.15±0.4113155030404.62±0.2214157040404.11±0.1215205030506.13±0.0716153040604.43±0.1117205040403.48±0.2118203040504.79±0.2019155050607.59±0.1820155040508.36±0.2221155040508.06±0.1422105040606.03±0.2323155050404.43±0.0724153030504.98±0.1125155040508.98±0.1226157030507.52±0.2327153050506.14±0.2128155040508.86±0.0529155030605.36±0.21由表3可知，所选模型F值=18.15，P0.000 1，表明各因素与其响应值之间有着极为显著的相关性，失拟项的P值为0.182 6，失拟项不显著，故该回归模型可用于预测碧根果青皮多酚提取工艺。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型93.500146.68018.1500.000 1***X11.76011.7604.7900.046 0*X211.620111.62031.5900.000 1***X31.87011.8705.0900.040 6*X420.310120.31055.1900.000 1***X1X28.94018.94024.3000.000 2***X1X30.01710.0170.0460.833 4X1X40.28010.2800.7600.397 0X2X30.45010.4501.2200.288 0X2X40.95010.9502.5800.130 3X3X41.46011.4603.9800.065 9X1212.220112.22033.2100.000 1***X2212.020112.02032.6700.000 1***X325.05015.05013.7300.002 4X4235.700135.70097.0500.000 1***残差5.150140.370失拟误差4.470100.4502.6200.182 6纯误差0.68040.170总离差98.65028注：R2=0.947 8，CV=9.82%，RAdj2=0.945 4，Adeq Precisior=12.915。由表3的回归方程分析可知，影响碧根果青皮多酚得率的最显著因素为X4，其次为X2、X3和X1。X1X2之间的交互作用对碧根果青皮多酚得率影响极显著；X1和X3之间的交互作用对碧根果青皮多酚得率具有显著影响（P0.05）。2.2.2响应面分析及优化（见图5~图10）由图5~图10可知，响应面值达到最高点后开始逐渐减小，其中X2和X4对碧根果青皮多酚得率存在极显著影响，X1和X3之间的交互作用对碧根果青皮多酚得率的影响显著（P0.05）。通过响应面软件优化分析得到最佳提取工艺为：液料比15 mL/g、乙醇体积分数50%、超声时间40 min、超声温度50 ℃，此工艺下碧根果青皮多酚得率为8.98%，与单因素试验的最高试验点一致。在最优条件下进行3次平行试验以验证试验结果的有效和可靠性，验证试验得到的多酚得率平均值为8.66%，表明模型优化碧根果青皮多酚具有实用价值，重复性较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F005图5乙醇体积分数与液料比对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F006图6超声时间与液料比对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F007图7超声温度与液料比对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F008图8超声温度与乙醇体积分数对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F009图9超声时间与乙醇体积分数对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F010图10超声温度与超声时间对多酚得率的影响2.3碧根果青皮多酚的抗氧化活性变化2.3.1模拟口腔唾液消化过程中DPPH·、OH·和·O2-的清除能力（见图11）由图11可知，在模拟口腔消化5 min时碧根果青皮多酚消化液的DPPH·、OH·和·O2-清除率分别为48.90%、56.17%和22.32%。在模拟消化15 min时，DPPH·、OH·和·O2-清除率均达到最大，分别为62.16%、72.32%和28.13%。在模拟消化20~30 min时，碧根果青皮多酚的抗氧化能力均呈下降趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F011图11模拟口腔唾液消化过程中DPPH·、OH·和·O2-的清除能力VC溶液对DPPH·、OH·和·O2-的清除率的影响见表4。由表4可知，所有试验范围内的DPPH·、OH·和·O2-清除能力均低于2 g/L的阳性对照。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.T004表4VC溶液对DPPH·、OH·和·O2-的清除率的影响VC浓度/(g/L)DPPH·清除率/%OH·清除率/%·O2-清除率/%0.556.31±0.1950.00±0.0967.65±0.381.061.06±0.1162.90±0.4875.13±1.222.082.55±1.0175.00±0.3684.02±0.443.084.99±0.4283.01±0.5291.23±0.114.087.96±0.4888.11±1.4394.88±0.375.094.32±0.3295.89±0.2895.37±0.282.3.2体外模拟胃液消化过程中DPPH·、OH·和·O2-的清除能力（见图12）由图12可知，在整个试验区间范围内呈先上升后下降的趋势，在模拟胃液消化1 h时，碧根果青皮多酚的·O2-清除能力最高为48.02%，在模拟胃液消化2 h时，碧根果青皮多酚清除DPPH·和OH·的能力达到最高为74.23%和71.16%。因此，碧根果青皮多酚具有较好的抗氧化能力。由表4可知但所有试验范围内的DPPH·、OH·和·O2-清除能力均低于2 g/L的阳性对照。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F012图12体外模拟胃液消化过程中DPPH·、OH·和·O2-的清除能力2.3.3模拟肠液消化过程中DPPH·、OH·和·O2-的清除率（见图13）由图13可知，体外模拟肠液消化5 min时碧根果青皮多酚消化液的DPPH·、OH·和·O2-清除率分别为44.23%、46.60%和36.72%。在小肠消化4 h时，DPPH·和·O2-清除率分别达到最大为62.23%和53.80%；OH·清除率在模拟消化6 h时达到最大清除率为72.56%。因此，碧根果青皮多酚具有较好的抗氧化能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.018.F013图13模拟肠液消化过程中DPPH·、OH·和·O2-的清除率由表4可知，所有试验范围内清除DPPH·的能力均低于2 g/L的阳性对照，而OH·和·O2-清除能力均低于1 g/L的阳性对照。3结论本试验采用响应面优化法优化分析超声辅助提取碧根果青皮多酚的工艺参数，此方法提取碧根果青皮多酚的最佳工艺参数为：液料比15 mL/g、乙醇体积分数50%、超声时间40 min、超声温度50 ℃，在此条件下多酚得率为8.96 mg/g。体外模拟口腔和胃肠道消化试验结果表明，碧根果青皮多酚消化产物在模拟口腔唾液15 min时，DPPH·、OH·和·O2-清除能力均达到最高，分别为62.16%、72.32%和28.13%。模拟胃液消化时，DPPH·和OH·清除率在消化2 h时最强，为74.23%和71.16%；·O2-清除率在1 h时最强，为48.02%。在模拟小肠消化时，DPPH·和·O2-清除率在消化4 h时达到最强，为62.23%和69.82%，OH·在模拟小肠消化6 h时达到最大，为72.56%。