九头狮子草又称尖惊药、土细辛、咳风尘、红蓝草等，分布于贵州、云南、四川、广西、广东等地区，主要生长在树林中潮湿的地方及溪流边、湖边等。云南、贵州等地常将九头狮子草作为五彩糯米饭中的红色素天然食品添加剂使用[1-3]。九头狮子草性味辛、凉，主要具有治疗咳嗽喉痛、清热、化痰、解毒、解热、抗菌、止痒、蛇咬伤和抗炎等作用[4-5]。绿原酸是中药材提取物中发挥药物疗效的主要生物活性物质之一，化学式为C16H18O9，是植物体中有氧代谢的产物[6]。绿原酸广泛应用于医药保健、食品、饲料添加剂及日用品行业[7-9]。绿原酸可作为一种绿色天然的保鲜剂，添加绿原酸后生鱼片的保鲜效果明显；饮料中加入绿原酸具有防腐变质作用[10-11]。畜牧生产中使用绿原酸可维持动物的肠道健康，促动物生长，改善肉的嫩度和口感等[12-15]。绿原酸还具有抗氧化、抗炎、抵抗肿瘤和辅助降压等作用[16-17]。王超英等[18]研究了九头狮子草作为一种天然红色素的理化性质。也有学者对九头狮子草的药理作用进行了综述[2,19]。研究发现，九头狮子草乙醇提取物对细胞损伤具有保护作用[20]。蒋小华等[21]利用GC-MS对九头狮子草中挥发油成分进行了分析。刘香等[22]采用波谱技术对九头狮子草的醇提物进行了鉴定分析。目前尚未见对九头狮子草中绿原酸提取工艺的研究，本试验以九头狮子草中绿原酸的提取率作为评价指标，乙醇体积分数、液料比、超声时间、超声温度为自变量，采用响应面法优化九头狮子草中绿原酸的提取工艺，为促进九头狮子草的进一步研究及绿原酸生产提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器九头狮子草药材的产地为广西桂林，经鉴定为九头狮子草，干燥，粉碎，过筛（40目），保鲜袋密封，置于干燥器中。主要试剂：绿原酸对照品（含量≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司）；其他试剂均为分析纯。主要仪器：T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、AR224CN电子天平（奥豪斯仪器有限公司）、KQ-100TDB数控超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1九头狮子草中绿原酸提取工艺平行称取0.5 g九头狮子草粉末6份，置于25 mL的容量瓶中，一定液料比下，分别加入一定浓度的乙醇溶液，置于设定温度的超声波仪器中超声一定时间，降温至室温，离心，取上清液作为九头狮子草绿原酸提取液。1.2.2单因素试验设计以九头狮子草中绿原酸提取率为试验考察指标。单因素试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.T001表1单因素试验设计试验设计乙醇体积分数（A）/%液料比（B）/(g/mL)超声时间（C）/min超声温度（D）/℃130、40、50、60、70、8030303024010、15、20、25、30、3530303402015、30、45、60、75、9030440207520、30、40、50、60、701.2.3响应面试验设计以单因素试验为基础，响应面因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.T002表2响应面因素水平设计水平A/%B/(mL/g)C/minD/℃-1301065300402075401503085501.2.4绿原酸标准曲线绘制分别准确配制浓度为0.004、0.006、0.008、0.012、0.016、0.020 g/L绿原酸对照溶液，328 nm处测定相应的吸光度A[23]，采用最小二乘函数法得绿原酸的线性回归方程：A=52.610 5C +0.016 6（R2=0.997 9），根据计算分析可得，绿原酸在0.004~0.020 g/L范围内呈良好的线性关系。1.2.5绿原酸提取率计算使用移液枪移取绿原酸提取液0.25 mL至容量瓶中，按照1.2.4方法测定其吸光度A，计算绿原酸提取率。提取率=提取液中绿原酸质量/样品质量(1)1.3数据统计与分析试验采用Excel 2010、Origin 8.0、Design Expert 11.0软件进行标准曲线、单因素、响应面试验数据的计算和分析，建立回归模型，试验数据均重复测定3次取平均值。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇体积分数对九头狮子草绿原酸提取率的影响（见图1）由图1可知，乙醇体积分数为40%时，绿原酸提取率最大，但随着乙醇浓度增大，不利于提取绿原酸，可能是绿原酸溶出增加的同时促使其他杂质溶出[24]，杂质可能与绿原酸产生反应生成其他物质。因此，试验选择30%、40%、50%的乙醇体积分数进行响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F001图1乙醇体积分数对九头狮子草中绿原酸提取率的影响2.1.2液料比对九头狮子草中绿原酸提取率影响（见图2）由图2可知，液料比为20 mL/g时，绿原酸提取率为1.06%，此条件下绿原酸提取率最大，之后呈下降趋势，表明高乙醇浓度会增大其与九头狮子草粉末的表面积接触，九头狮子草中绿原酸扩散速率也提高[25-26]。因此，选择10、20、30 mL/g的液料比进行响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F002图2液料比对九头狮子草中绿原酸提取率的影响2.1.3超声时间对九头狮子草中绿原酸提取率影响（见图3）由图3可知，75 min时绿原酸提取率到达峰值。因为提取初始九头狮子草中绿原酸不能快速完全溶出，随提取时间延长，绿原酸渐渐被溶出；但随超声时间过长，一些杂质溶出可能吸附部分绿原酸，从而降低了绿原酸的浓度[27]。因此，选择65、75、85 min超声时间作为响应面试验的3个水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F003图3超声时间对九头狮子草中绿原酸提取率的影响2.1.4超声温度对九头狮子草中绿原酸提取率影响（见图4）由图4可知，超声温度40 ℃时绿原酸提取率达峰值1.52%，之后绿原酸提取率迅速下降，可能是热效应降解了部分绿原酸，或绿原酸邻二酚羟基结构不稳定加速其分解[28]。因此，选择超声温度30、40、50 ℃作为响应面试验的3个水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F004图4超声温度对九头狮子草中绿原酸提取率的影响2.2响应面试验结果2.2.1响应面试验设计（见表3、表4）选取表3中A、B、C、D作为响应面试验的4因素，绿原酸提取率（Y）为因变量，以单因素试验结果确定响应面试验中4个因素的水平范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.T003表3响应面试验设计结果试验号ABCD绿原酸提取率（Y）/%1-1-1000.3921-1000.563-11000.72411001.12500-1-11.106001-11.16700-111.65800111.599-100-10.7610100-11.0111-10011.081210011.43130-1-100.981401-100.91150-1100.511601101.6117-10-100.621810-101.2719-10100.922010100.89210-10-10.6822010-11.13230-1010.962401011.732500001.572600001.592700001.502800001.462900001.48经拟合分析得到二次多元回归方程为：Y=1.52+0.15A+0.26B+0.013C+0.22D+0.057AB-0.17AC+0.025AD+0.290BC+0.080BD-0.030CD-0.45A2-0.38B2-0.14C2-7.5×10-3D2。由表4可知，该模型P0.000 1，失拟项P0.05，表明此试验模型拟合性好，试验方法可行。决定系数R2=0.988 6，表明九头狮子草中绿原酸提取率与模型的预测值一致性好，调整决定系数为Radj2=0.977 2，表明试验结果真实可靠、拟合程度高。由F值可知，对九头狮子草中绿原酸提取率影响大小为：BDAC，且A、B、D项P0.000 1，影响极显著；AC、BC、A2、B2、C2项的P0.000 1，影响极显著；BD项P0.05，影响显著；AB、AD、CD、D2项的P0.05，影响不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型4.150140.30086.530.000 1**A0.27010.27078.000.000 1**B0.82010.820240.020.000 1**C1.880×10-311.880×10-30.550.471 5D0.56010.560164.560.000 1**AB0.01310.0133.860.069 5AC0.12010.12033.770.000 1**AD2.500×10-312.500×10-30.730.407 2BC0.34010.34099.970.000 1**BD0.02610.0267.480.016 1*CD3.600×10-313.600×10-31.050.322 5A21.29011.290377.340.000 1**B20.94010.940273.620.000 1**C20.13010.13037.810.000 1**D23.649×10-413.649×10-40.110.748 9残差0.048143.423×10-3失拟项0.035103.492×10-31.070.515 7纯误差0.01343.250×10-3总和4.20028注：1.“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。2.R2=0.988 6，Radj2=0.977 2。2.2.2响应面和等高线图分析（见图5）在三维曲面响应面图中，坡度的倾斜度越大、越陡峭或呈马鞍形时，表明两因素对绿原酸提取率影响越显著[29]。等高线形状排列较密或呈椭圆形，两因素间交互作用强，而呈圆形则表明交互作用弱[30-31]。由图5可知，乙醇体积分数和液料比或超声温度、超声时间和超声温度等3个交互项三维曲面图中坡度较平缓而小，等高线排列较稀疏，形状又接近圆形，表明AB、AD、CD交互项对九头狮子草中绿原酸提取率影响不显著。超声时间和乙醇体积分数或超声时间等交互项三维曲面图中明显呈现出坡度较陡峭的趋势，等高线密且似椭圆状，表明AC、BC交互项影响极显著。液料比和超声温度交互项之间的坡度稍陡峭，等高线图又呈椭圆形，表明影响较显著。以上分析与方差分析结果一致，模型符合要求。图5交互作用对九头狮子草中绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F5a1（a）液料比与乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F5a2（b）超声时间与乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F5a3（c）超声温度与乙醇体积分数对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F5a4（d）超声时间与液料比对绿原酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F5a5（e）超声温度与液料比对绿原酸提取10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.017.F5a6（f）超声温度与超声时间对绿原酸提取率的影响2.2.3响应面试验结果优化验证借助软件分析响应面试验可预测模型的最佳提取工艺，即乙醇体积分数41.33%、液料比26.74 mL/g、超声时间80.58 min、超声温度50 ℃。根据试验实际情况调整为乙醇体积分数40%、液料比25 mL/g、超声时间80 min、超声温度50 ℃。此条件进行3次平行试验，测得绿原酸提取率为1.82%，与试验预测模型绿原酸提取率1.85%相比，与预测值接近，表明此条件可作为测定九头狮子草中绿原酸提取率的最佳工艺条件。3结论本试验以乙醇为溶剂，通过单因素和响应面试验得到提取绿原酸的最佳工艺条件，即乙醇体积分数40%、液料比25 mL/g、超声时间80 min、超声温度50 ℃，绿原酸提取率为1.82%。本试验操作具有简单易行、周期短、稳定性好等优点，可为九头狮子草的进一步研究开发与广泛应用提供参考。