复方中药基于中医理论，按照“君臣佐使”原则配伍，采用具有互补作用的中草药，以达到最佳的使用效果[1]。复方中草药作为一种绿色添加剂，可以抑制病原体繁殖，提高机体抗感染能力[2]。中草药具有低残留、低耐药性、安全等优点[3]，可以作为抗生素替代品在动物生产中应用。肠道微生物对动物机体内营养物质的消化吸收、免疫反应与代谢活性等方面具有重要作用，能够影响动物的生长发育与健康。近年来，关于当归[4]、人参[5]、枸杞[6]、黄芪[7]、淫羊藿[8]等多种中草药对动物肠道微生物影响的研究较多。因此，本试验研究复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿直肠菌群多样性的影响，为深入探究复方中草药添加剂调控梅花鹿直肠菌群的具体机制提供参考。1材料与方法1.1试验材料复方中草药由黄芪、当归、人参、枸杞、益母草、五味子、党参、熟地黄、丹参、淫羊藿等按一定比例组成，均购自安徽亳州中药材市场。1.2试验地点试验于农业农村部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站进行。1.3试验动物及试验设计选取3岁龄、体重（74.79±0.78）kg、健康雄性梅花鹿12头，随机分为2组，每组6个重复，每个重复1头鹿，对照组（SC组）梅花鹿饲喂基础饲粮，试验组（ST）在基础饲粮中添加10 g/(头·d)的复方中草药添加剂。基础饲粮组成及营养水平见表1。预试期7 d，正式试验期7 w。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.013.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米42.65干物质/%88.81青贮秸秆20.59有机物/%79.16棕榈粕13.88粗蛋白质/%14.87酒糟蛋白8.88粗脂肪/%3.11豆粕6.66钙/%0.75苜蓿粉5.55磷/%0.27预混料1.10中性洗涤纤维/%45.20食盐0.69酸性洗涤纤维/%12.37总能/(MJ/kg)16.04注：1.预混料为每千克饲粮提供：MgO 0.083 g、ZnSO4·H2O 0.039 6 g、MnSO4·H2O 0.047 3 g、FeSO4·H2O 0.058 3 g、NaSeO3 0.034 g、VA 532.4 IU、VD3 546.48 IU、VE 0.911 IU、VK3 0.253 mg、VB1 0.101 mg、VB2 0.759 mg、VB12 0.002 mg、叶酸 0.025 3 mg、烟酸 1.782 mg、泛酸1.265 mg、CaHPO4 5.687 mg、CaCO3 5.027 mg2.营养水平均为实测值。1.4饲养管理梅花鹿按照养殖场统一饲养模式管理，每天4：30和15：30定量饲喂，自由饮水。1.5测定指标及方法1.5.1样品采集试验最后1 d，晨饲前对梅花鹿颈静脉麻醉，使用无菌棉签刮取梅花鹿直肠末端粪便样本约5 g，放入无菌冻存管，液氮超低温保存。1.5.2直肠菌群多样性分析将直肠粪便样本送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rDNA高通量测序，所用引物序列为515F:5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。对测序得到的PE reads进行去引物、质量过滤和拼接。利用Uparse软件根据97%的相似度对序列进行操作分类单元（OTU）聚类并剔除嵌合体。利用Qiime软件计算α-多样性指数。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel 2019进行初步整理，SPSS 26.0进行独立样本t检验，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1数据质控分析结果本研究共收集到10个有效直肠粪便样本，从10个直肠粪便样本中生成617 127个有效序列，序列平均长度为413.1 bp。OTU韦恩图见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.013.F001图1OTU韦恩图由图1可知，基于97%相似性水平对非重复序列进行OTU聚类，共获得个4 171 OTU，其中SC组和ST组分别为3 636和3 390个，特有OTU数分别为781和535个。2.2复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿直肠菌群α-多样性的影响（见表2）由表2可知，ST组和SC组梅花鹿直肠Shannon、Simpson、Chao和Ace指数差异不显著（P0.05），表明饲粮添加复方中草药对生茸期梅花鹿直肠内容物菌群α-多样性无明显影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.013.T002表2复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿直肠菌群α-多样性的影响项目Shannon指数Simpson指数Chao1指数Ace指数P值0.5840.3870.1020.082SC组8.73±0.030.990 1±0.000 13 178.95±421.912 678.54±131.10ST组8.62±0.190.991 0±0.000 92 243.33±279.552 082.77±253.182.3梅花鹿直肠菌群主成分分析（见图2）由图2可知，2个坐标轴相加能够解释67.51%的变量组成，表明饲粮添加复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿直肠内容物细菌组成无明显影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.013.F002图2梅花鹿直肠菌群主成分分析2.4复方中草药添加剂对生茸期梅花鹿直肠菌群多样性的影响（见图3、图4）由图3可知，SC组和ST组梅花鹿的直肠菌群在门水平上主要归类为厚壁菌门55.15%、拟杆菌门27.59%和变形菌门4.68%。ST组梅花鹿的3个重复的酸杆菌门的相对丰度较低，表明饲粮添加复方中草药添加剂可能会抑制生茸期梅花鹿直肠酸杆菌门相对丰度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.013.F003图3门水平相对丰度注：SC1、SC2、SC3、SC4、SC5为对照组的5个重复，ST1、ST2、ST3、ST4、ST5为试验组的5个重复；下图同。由图4可知，在属水平上，SC组和ST组梅花鹿的直肠相对丰度较高的菌群分别为瘤胃球菌属UCG-005 15.18%、理研菌科RC_9 6.75%、克里斯滕菌属R7 2.88%、Monoglobus 2.77%、另枝菌属2.76%、拟杆菌属2.27%和毛螺菌科NK4A136群1.72%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.013.F004图4属水平相对丰度与SC组相比，ST组梅花鹿直肠的Monoglobus相对丰度显著提高（P0.05），2组梅花鹿的直肠菌群在其他属水平上无明显区别。3讨论3.1复方中草药添加剂的成分和作用机制中草药是天然植物，具有营养和药理作用[9]。研究表明，中草药能够预防动物疾病，提高机体非特异性免疫能力和抗病能力[10]。当归能够通过抑制白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等炎性介质的释放，阻断NF-κB和MAPK等炎症信号通路中相关基因、蛋白的表达发挥抗炎作用[11]。党参具有保护黏膜免疫损伤及抑制病原菌定植的作用[12-13]。枸杞对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等均具有抑制作用[14]。五味子可用于治疗细菌性感染的消化系统疾病，改善肠道蠕动，缓解腹泻症状[15-16]。黄芪对痢疾杆菌、金黄色葡糖球菌等具有抑制作用，能够增加肠黏膜的吸收功能，促进营养物质的消化吸收[17]。淫羊藿具有抑菌作用，其成分总黄酮可以抑制白色葡萄球菌、大肠杆菌、青霉、黑曲霉等常见肠道病毒[18]。根据中草药的药理作用按一定比例配制，可以消除胃肠道内的致炎因子，维护肠道健康，从而促进营养物质的消化吸收。3.2复方中草药添加剂对梅花鹿直肠菌群多样性的影响动物肠道微生物与机体的消化、免疫、生理调控等方面息息相关[19-20]。复方中草药添加剂能够促进肠道健康，调节动物肠道菌群组成[9,21-22]。王芳芳等[23]研究发现，复方中草药添加剂（黄芩、金银花、白芍、椿皮、黄芪、马齿苋）进入仔猪肠道，能够抑制肠道有害菌（大肠杆菌）的繁殖，促进肠道有益菌（乳酸杆菌）生长，降低断奶仔猪的腹泻率。韩金恒等[24]研究发现，复方中草药添加剂（黄芪、甘草、党参、陈皮、当归、白术、升麻）能够改善肉鸡肠道菌群的结构和比例，提高粪杆菌属的相对丰度。本试验条件下，2组梅花鹿直肠内容物微生物中的优势菌门为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，与Guan等[25]在梅花鹿中的研究结果一致。本试验中，ST组梅花鹿3个重复的酸杆菌门的相对丰度较低，表明饲粮添加复方中草药添加剂可能会抑制梅花鹿直肠酸杆菌门相对丰度，但不排除这3头梅花鹿异常的可能。Monoglobus是降解纤维的特殊细菌，专门分解植物中难以消化的物质[26]。本试验中，与SC组相比，ST组梅花鹿直肠Monoglobus相对丰度显著提高，表明饲粮添加复方中草药添加剂能够促进梅花鹿对纤维的消化。4结论饲粮添加复方中草药添加剂并未明显影响生茸期梅花鹿直肠细菌组成，但提高了梅花鹿直肠内容物中Monoglobus的相对丰度，从而促进梅花鹿对纤维的消化吸收。