杜仲又名胶木，属于二级珍稀自然保护植物，具有抗衰老、抗氧化、降血压、降血脂、抗菌及抗病毒等作用[1-2]。杜仲叶中含有多种活性成分，如黄酮类、绿原酸、木脂素类等化合物[3-5]。黄酮类化合物是自然界中的天然抗氧化剂，具有保护肝脏、抗炎、调节免疫以及降血脂等作用[6]。因此，杜仲叶在生物医药、保健产品和饲料工业等领域具有广泛的应用前景[7-10]。抗生素在动物饲粮中应用会造成畜禽产品中的抗生素残留，耐药菌株产生，对人体健康造成危害[11]。2020年7月1日起国家禁止在饲料中使用抗生素[12]。因此，需要寻找高效、安全的抗生素替代品以满足畜禽生产的需求。杜仲叶具有较高的营养价值和生物活性，能够改善禽畜的生长性能，提高动物的免疫力和存活率，是具有潜力的抗生素替代品[13-15]。李世传[16]研究发现，在饲粮中添加一定量的杜仲叶或其提取物，能够提高猪的生长性能，增强机体免疫力，改善猪肉品质。Yang等[17]研究发现，在草鱼饵料中添加64.4 g/kg杜仲叶总黄酮能够使草鱼体重提高18.6%。饲粮中黄酮类物质可通过促进益生菌生长，平衡肠道菌群，抑制病原菌在肠道内的定植，从而增加有益菌数量，促进肠道对营养物质的吸收。目前，提取黄酮的方法有水提法、超声提取法、微波提取法、酶解法等[18]，但是仅靠一种提取方法进行提取的效率较低。超声波辅助酶法是超声波提取法和酶提取法组合的一种提取方法，能够将温和的生物酶水解条件和快速的超声波提取技术结合，保护黄酮类化合物的最大生物活性，同时具有两种提取方法的优点。本文通过超声波辅助酶法提取杜仲叶中的总黄酮，在单因素基础上，利用响应面法优化，为杜仲中黄酮化合物的研究及开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料杜仲叶采自漯河本地，挑选无病、无虫、无害、新鲜的杜仲叶，洗净，60 ℃恒温烘干24~48 h，粉碎，过60目筛（需二次过筛），过筛后密封，避光保存。1.2试验仪器与试剂1.2.1试验仪器FA2004电子分析天平购自上海上平仪器有限公司，202-0ES电热恒温干燥箱购自北京市永光明医疗仪器有限公司，HH-8型数显恒温水浴锅购自金坛区杰瑞尔电器有限公司，SB-800D超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司，LXJ-ⅡB低速离心机购自上海安亭科学仪器厂，UV-2600型紫外可见光分光光度计购自尤尼柯（上海）仪器有限公司，PHS-3CT酸度计购自上海盛磁仪器有限公司。1.2.2主要试验试剂纤维素酶、芦丁标准品（HPLC≥98%）均购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、盐酸均购自开封市方晶化学试剂有限公司；亚硝酸钠、氢氧化钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司；硝酸铝购自广东西陇化工厂。1.3试验方法1.3.1芦丁标准曲线的制备精确称取芦丁标准品0.020 0 g，使用60%乙醇溶液溶解，定容至100 mL，得到浓度为0.2 g/L标准使用液。准确移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL标准使用液于10.00 mL比色管中，依次加入5%亚硝酸钠溶液0.30 mL，充分摇匀，静置6 min，依次加入10%硝酸铝溶液0.30 mL，充分摇匀，静置6 min，依次加入1 mol/L氢氧化钠溶液4.00 mL，使用30%乙醇溶液定容，摇匀，静置15 min。将分光光度计的波长调至510 nm，以空白溶液为作为参比，测定吸光度，以芦丁的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。1.3.2样品溶液的制备准确称取1.000 0 g杜仲样品粉末于100 mL三角瓶中，按一定的料液比加入一定浓度的乙醇30 mL，调节pH值至5.0；加入纤维素酶，在适当温度、适当时间进行酶解，进行超声处理，提取后高温灭酶2 min，离心去沉淀，得到提取液，使用30%乙醇溶液定容至100 mL。1.3.3杜仲叶中总黄酮得率的计算取1.0 mL待测溶液测定样品吸光度，计算样品中总黄酮得率。X=cVm×106×100% (1)式中：X为总黄酮得率（%）；m为样品质量（g）；c为根据标准曲线得到的浓度（mg/L）；V为根据浸提液换算的总体积（mL）。1.3.4单因素试验设计1.3.4.1酶加量对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值为5，液料比为30 mL/g，乙醇浓度为60%，选取纤维素酶分别为2、4、6、8、10、12 mg，50 ℃酶解60 min，超声处理15 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同酶加量对总黄酮得率的影响。1.3.4.2液料比对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值5，按照液料比为10、20、30、40、50 mL/g，乙醇浓度为60%，选取纤维素酶10 mg，50 ℃酶解60 min，超声处理15 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同料液比对总黄酮得率的影响。1.3.4.3超声时间对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值5，液料比为30 mL/g，乙醇浓度为60%，纤维素酶为10 mg，50 ℃酶解60 min，超声处理时间分别为5、10、15、20 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同超声时间对总黄酮得率的影响。1.3.4.4酶解pH值对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0，液料比为30 mL/g，乙醇浓度为60%，纤维素酶为10 mg，50 ℃酶解60 min，超声处理15 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同酶解pH值对总黄酮得率的影响。1.3.4.5乙醇浓度对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值为5，液料比为30 mL/g，乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%，纤维素酶为10 mg，50 ℃酶解60 min，超声处理15 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同浓度的乙醇对总黄酮得率的影响。1.3.4.6酶解时间对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值为5，液料比为30 mL/g，乙醇浓度为60%，纤维素酶为10 mg，50 ℃条件下，酶解时间分别为30、45、60、75、90 min，超声处理15 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同酶解时间对总黄酮得率的影响。1.3.4.7酶解温度对杜仲叶中总黄酮得率的影响在pH值5，液料比为30 mL/g，乙醇浓度分别为60%，纤维素酶为10 mg，50 ℃酶解60 min，酶解温度分别为40、45、50、55、60 ℃，超声处理15 min，对杜仲叶总黄酮进行提取，研究不同酶解温度对总黄酮得率的影响。1.3.5Box-Behnken试验设计根据单因素试验的结果，利用响应面法对试验方案进行优化。固定乙醇浓度60%，酶解pH值5.0，酶解温度55 ℃，对酶加量（A）、液料比（B）、超声时间（C）、酶解时间（D）进行4因素3水平的试验设计，响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.T001表1响应面因素水平设计水平A/mgB/(mL/g)C/minD/min-182010600103015751124020901.3.6验证试验利用Design-Expert 8.0.6软件，可以得到各个因素的最优取值和理论上的总黄酮得率。根据软件分析的结果，进行适当修正，进行验证试验。1.4数据统计与分析采用SPSS、Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行处理分析。2结果与分析2.1芦丁标准曲线（见图1）由图1可知，芦丁标准曲线的相关系数R2=0.999 5，芦丁的质量浓度在0~50 mg/L时，芦丁质量浓度和吸光度具有很好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F001图1芦丁标准曲线2.2单因素试验结果2.2.1酶加量对总黄酮得率的影响（见图2）由图2可知，当酶加量在2~10 mg时，总黄酮得率有上升趋势，当加入纤维素酶10 mg时，得率达到最大值，之后得率呈下降趋势。可能是因为纤维素酶起破坏杜仲叶细胞壁的作用，促进了黄酮释放，所以得率会增加，但当纤维素酶增加到一定量时，杜仲叶中总黄酮已完全浸出，溶液会变得黏稠，纤维素酶的作用受到抑制，导致得率下降[19]。因此，选择酶加量为10 mg进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F002图2酶加量对总黄酮得率的影响2.2.2液料比对总黄酮得率的影响（见图3）由图3可知，当增加浸提液的体积时，总黄酮得率先增加后下降，当液料比为30 mL/g时，得率达到最大值。可能是由于随着浸提液体积的增大，促进了杜仲叶中的黄酮溶出[20]，液料比逐渐增大，酶和底物的浓度会变小，底物未得到充分酶解[21]，所以得率呈下降趋势。因此，选择液料比为30 mL/g进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F003图3液料比对总黄酮得率的影响2.2.3超声时间对总黄酮得率的影响（见图4）由图4可知，随着超声时间延长，总黄酮得率缓慢上升，当超声处理15 min时达到最大值，继续延长超声时间，得率急剧下降。可能是由于在15 min前，已经将杜仲叶中的黄酮类化合物提取完全，超声具有很强的机械效应，破坏了杜仲叶的细胞壁，如果超声时间过长，会导致黄酮类化合物的结构发生变化[22-23]，从而导致得率降低。因此，选择超声时间15 min进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F004图4超声时间对总黄酮得率的影响2.2.4酶解pH值对总黄酮得率的影响（见图5）由图5可知，pH值在3~5时，总黄酮得率逐渐增大，在pH值为5时，得率达到最大值，之后当提取液的环境接近中性时，得率有下降趋势。可能是由于酶解pH值对纤维素酶水解细胞壁有影响，在反应的过程中，如果酸过多，会导致纤维素酶的生物活性降低[24]，所以总黄酮得率降低。因此，选择pH值为5进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F005图5酶解pH值对总黄酮得率的影响2.2.5乙醇体积分数对总黄酮得率的影响（见图6）由图6可知，随着乙醇体积分数的增大，总黄酮得率先缓慢升高后大幅度下降，当乙醇体积分数为60%时，得率达到峰值。因此，浓度过低或过高时均不利于黄酮的提取，这可能与黄酮类化合物的种类有关[25]，选择乙醇体积分数为60%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F006图6乙醇体积分数对总黄酮得率的影响2.2.6酶解时间对总黄酮得率的影响（见图7）由图7可知，随着酶解时间缓慢增加，总黄酮得率在75 min时取得最大值，推测在75 min内，纤维素酶可以将杜仲叶的细胞壁完全水解，让更多黄酮物质溶出，但在75~90 min内，酶解处理时间过长，纤维素酶的催化活性降低[26]，导致得率降低。因此，选择酶解时间为75 min进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F007图7酶解时间对总黄酮得率的影响2.2.7酶解温度对总黄酮得率的影响（见图8）由图8可知，当用不同的温度处理时，随酶解温度升高，总黄酮得率先一直缓慢升高，之后得率大幅度下降。当酶解温度为55 ℃，得率达到了最大值，原因是不同的温度对纤维素酶活性均有影响，当温度低时，纤维素酶不能很好地发挥其活性，而高温又会使酶失活[21,27]。只有在适当的温度下，才能够进行有效的酶解反应。因此，选择酶解温度为55 ℃进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F008图8酶解温度对总黄酮得率的影响2.3响应面试验结果与分析2.3.1响应面试验结果（见表2）应用Design-Expert 8.0.6软件分析，进行数据处理，得到杜仲叶中的总黄酮得率与酶加量（A）、液料比（B）、超声时间（C）、酶解时间（D）的回归模型为：总黄酮得率（%）=3.373+0.022A-0.015B+0.019C-0.004D+0.018AB+0.022AC+0.048AD-0.088BC+0.024BD+0.015CD-0.087A2-0.107B2-0.131C2-0.102D2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.T002表2响应面试验结果试验号ABCD总黄酮得率/%10-10-13.21820-1103.2403-1-1003.1944-10103.1535-10-103.1356010-13.139700003.367800003.3899-11003.1331010013.2661100-113.09912-100-13.19413-10013.09614001-13.1451500003.3741600-1-13.1271700003.34918100-13.174190-1-103.0582001103.0312110103.2292200113.176230-1013.149241-1003.1832501013.1652600003.3862710-103.1232811003.1942901-103.2032.3.2响应面的方差分析（见表3）由表3可知，影响杜仲叶中总黄酮得率的因素排序为：酶加量（A）超声时间（C）液料比（B）酶解时间（D），模型的F值为52.79，P值小于0.000 1，表明该模型具有很好的显著性。通过Design-Expert 8.0.6软件分析得到该模型的确定系数R2=0.981 4，表明该模型约有98.14%的反应变异性；调整系数Radj2=0.962 8，表明该模型的拟合程度较好，可以准确预测提取杜仲叶中总黄酮的最佳工艺条件。该模型失拟项不显著，表明此模型能够很好地预测杜仲叶中的总黄酮得率；因素A、因素C对杜仲叶中总黄酮得率的影响极显著，因素B影响显著；交互项AD、BC、A2、B2、C2、D2影响极显著，交互项AC、BD影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.T003表3响应面的方差分析项目平方和自由度均方F值P值显著性模型0.257141.835×10-252.7900.000 1**A5.834×10-315.834×10-316.7800.001 1**B2.556×10-312.556×10-37.3500.016 9*C4.346×10-314.346×10-312.5000.003 3**D1.660×10-411.660×10-40.4790.500 4AB1.332×10-311.332×10-33.8300.070 6AC1.941×10-311.941×10-35.5800.033 1*AD9.103×10-319.103×10-326.1900.000 2**BC3.129×10-213.129×10-290.0300.000 1**BD2.262×10-312.262×10-36.5100.023 1*CD8.640×10-418.640×10-42.4900.137 1A24.863×10-214.863×10-2139.8900.000 1**B27.493×10-217.493×10-2215.5600.000 1**C21.114×10-111.114×10-1320.6200.000 1**D26.800×10-216.800×10-2195.6300.000 1**残差4.866×10-3143.480×10-4失拟项3.829×10-3103.830×10-41.4800.377 0不显著纯误差1.037×10-342.590×10-4总和0.26228注：“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。2.3.3各交互作用对黄酮得率影响2.3.3.1酶加量与液料比的交互作用对总黄酮得率的影响（见图9）由图9可知，酶加量在8~10 mg，液料比对总黄酮得率的影响是先增大后减小；液料比在20~40 mL/g范围内，酶加量对总黄酮得率的影响呈先升高后降低的趋势，无明显的峰值，整体变化趋势不大。由等高线图可知，坡度比较平缓，且等高线偏圆，表明酶加量与液料比交互作用不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F009图9酶加量与液料比的交互作用对总黄酮得率的影响2.3.3.2酶加量与超声时间的交互作用对总黄酮得率的影响（见图10）由图10可知，当固定酶加量时，超声时间对总黄酮得率的影响先升高后降低；当固定超声时间不变时，随纤维素酶量增加，总黄酮得率呈先增大后减小的趋势，有明显峰值，且两者变化趋势明显，表明酶加量与超声时间对总黄酮得率具有显著影响，从等高线图可知，酶加量与超声时间交互作用显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F010图10酶加量与超声时间的交互作用对总黄酮得率的影响2.3.3.3酶加量与酶解时间的交互作用对总黄酮得率的影响（见图11）由图11可知，当固定酶加量时，酶解时间对总黄酮得率的影响有先增大后减小的趋势，当酶解时间一定时，纤维素酶加量对总黄酮得率的影响有先升高后降低的趋势，两者均有峰值，整体变化趋势比较平缓，但等高线有明显呈椭圆，变化趋势较大，表明酶加量与酶解时间的交互作用显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F011图11酶加量与酶解时间的交互作用对总黄酮得率的影响2.3.3.4液料比与超声时间的交互作用对总黄酮得率的影响（见图12）由图12可知，超声时间和液料比对总黄酮得率的影响均是显著的，在液料比固定时，随着超声时间的延长，总黄酮得率有先增大后减小的趋势，超声时间同理，且曲面较陡，表明液料比与超声时间的交互作用是极显著的。可能是由于超声处理的过程中，产生了较强的机械作用，从而破坏了杜仲叶的细胞壁，使浸出的黄酮，因时间长导致结构发生变化，所以得率会急剧下降[28]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F012图12液料比与超声时间的交互作用对总黄酮得率的影响2.3.3.5液料比与酶解时间的交互作用对总黄酮得率的影响（见图13）由图13可知，当液料比固定时，总黄酮得率会随着酶解时间的延长先升高后降低，当酶解时间固定时，总黄酮得率会随着液料比的增大先缓慢上升后下降，但变化的趋势较明显，表明总黄酮得率受液料比的影响比酶解时间的影响更显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F013图13液料比与酶解时间的交互作用对总黄酮得率的影响2.3.3.6超声时间与酶解时间的交互作用对总黄酮得率的影响（见图14）由图14可知，当固定超声时间不变时，酶解时间在60~90 min内，总黄酮得率先缓慢上升后缓慢下降，且有峰值；当固定酶解时间不变时，超声时间在10~15 min内，总黄酮的得率先升高后下降，峰值明显，变化的趋势比酶解时间的趋势较陡，表明超声时间对总黄酮得率的影响比酶解时间更显著。从等高线图可知，等高线变化坡度很小，表明两者交互作用不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.17.016.F014图14超声时间与酶解时间的交互作用对总黄酮得率的影响2.4验证试验应用Design-Expert 8.0.6软件得到杜仲叶中提取总黄酮的提取条件为：酶加量10.27 mg、液料比28.96 mL/g、超声时间15.59 min、酶解时间75.14 min。在优化的条件下，理论提取的总黄酮得率为3.376%。在最佳的提取条件下，进行验证试验，根据优化条件，将提取条件修正为酶加量10.3 mg、液料比29 mL/g、超声时间16 min、酶解时间75 min。经验证试验得总黄酮得率为3.295%，占理论值的97.6%。理论值与实际值很接近，误差为0.081%，表明该试验的拟合性能较好，具有很好的分析预测能力。3结论通过响应面法优化杜仲叶中提取黄酮类化合物的最佳工艺为：酶加量10.27 mg、液料比28.96 mL/g、超声时间15.59 min、酶解时间75.14 min，总黄酮得率为3.376%。因此，利用超声波法和酶解法相结合的方法提取杜仲叶总黄酮，可获得较高的总黄酮得率，表明试验所用方法具有可行性。