沃柑是柑橘类水果的新品种，长势旺盛，挂果能力强，产量可达1 500 kg/667 m2，分布于我国广西、云南、四川、重庆等地。目前对沃柑的研究主要集中在栽培及病虫害的防治[1-4]，对沃柑皮成分的关注较少。柑橘类果皮渣因含有对动物生长有益的成分[5-7]而应用于畜禽饲料生产[8]。与其他柑橘类水果类似，沃柑皮散发特殊的芳香味且含有一定量的香精油。植物精油具有明显的抑菌作用，可减少饲料中抗生素的使用量[9]，能够提高哺乳动物的生长性能和机体免疫力，缓解氧化应激，维持肠道健康[10]，提高禽类动物生长性能、产蛋性能及蛋品质[11-13]。饲料中添加橙皮精油[14]和柠檬皮精油[15]可改善畜禽动物健康。植物精油中的百里香酚、肉桂醛、香芹酚等是广泛应用于畜禽养殖的活性化合物[16]。常用于精油提取的方法有水蒸气蒸馏[17-18]、无溶剂蒸馏[19]、溶剂萃取法[20]、压榨法[21-22]。压榨法利用外力破碎物料并从中挤压出精油，可在常温或低于常温下进行精油提取，保存活性物质效果较好。目前暂无关于沃柑皮精油提取及成分分析的报道，本文探索石灰水、超声波预处理及压榨法提取沃柑皮精油的工艺，分离鉴定沃柑皮精油的挥发性成分，为沃柑皮精油在功能饲料方面的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料沃柑（四川省资中县）；氢氧化钙、无水硫酸钠、二氯甲烷，均为分析纯（天津市永大化学试剂有限公司）。KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、小型慢速螺旋压榨机（飞利浦公司）、GC6890N-MS5937型气相色谱-质谱-计算机联用仪（Agilent Technologies公司）。1.2测定指标及方法1.2.1沃柑皮精油的提取与工艺优化1.2.1.1精油提取方法挑选新鲜、无霉变的沃柑，洗净，取皮，室温下（25 ℃）阴凉通风处干燥120 h。于50 g的沃柑皮中加入一定量和一定pH值的石灰水，在一定功率下超声波预处理一定时间，取出沃柑皮流水漂洗干净后沥干，螺旋式压榨机压榨得油水混合物，经布袋过滤去除残渣。混合液离心使用注射器吸取上层油状液体，适量干燥剂脱水得沃柑皮精油，称重，计算出油率。出油率=精油质量/沃柑皮重×100%(1)1.2.1.2工艺优化单因素试验：以预处理石灰水液料比10 mL/g、pH值9、超声波功率240 W、超声处理时间60 min为基础，固定其中3个因素，改变其中1个因素探索该因素对提取的影响，每个因素设置5个水平。响应面试验：根据单因素试验结果设置试验条件以进一步优化提取工艺，每个因素设置3个水平，响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.T001表1响应面因素水平设计水平A液料比/(mL/g)B pH值C超声波功率/WD超声处理时间/min-181024060010113207011212400801.2.2沃柑皮精油成分分析最优工艺条件下提取沃柑皮所得精油，适量无水CH2Cl2稀释，GC-MS分析成分。色谱：DB-5MS为色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦，流速为1.0 mL/min。50 ℃维持5 min，按照3 ℃/min升温到100 ℃，维持3 min；以5 ℃/min升温到250 ℃，维持3 min；分流比5∶1。质谱：电离方式EI，能量70 eV，源温度230 ℃，扫码范围m/z 45~550。2结果与分析2.1单因素试验结果（见图1~图4）由图1可知，随着液料比增大，沃柑皮精油的出油率升高，液料比达10 mL/g后，出油率趋于稳定。原因是液料比较低时，沃柑皮未被石灰水充分浸泡，纤维素网络结构未被充分溶胀和破坏，一定程度上影响了沃柑皮精油的出油率。当液料比达10 mL/g时，沃柑皮充分被浸泡、溶胀，继续增大液料比对出油率影响不大，表现出沃柑皮精油的出油率趋于稳定。因此，初步确定最佳液料比在10 mL/g左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F001图1液料比对出油率的影响由图2可知，沃柑皮精油的出油率随着浸泡沃柑皮石灰水pH值的升高而增大，当pH值达到11后，沃柑皮精油的出油率趋于最大值。原因是石灰水pH值较低时，不利于对沃柑皮纤维素网络结构的破坏，一定程度上影响了沃柑皮精油的出油率；但pH值太高也可能导致沃柑皮精油被破坏。因此，初步确定浸泡沃柑皮石灰水最佳pH值在11左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F002图2pH值对出油率的影响由图3可知，沃柑皮精油的出油率随着预处理超声波功率的升高增大，超声波功率达到320 W后，出油率趋于最大值。超声波功率决定了一定时间内物料吸收超声波能量的大小，超声波功率越大，物料短时间内吸收的能量越多，物料越容易被溶胀，越有利于精油提取，但功率过大会造成能量的浪费。因此，初步确定预处理的超声波功率最佳值处于320 W左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F003图3功率对出油率的影响由图4可知，沃柑皮精油的出油率随着超声波预处理时间的延长而升高，超声波预处理时间达到70 min后，出油率趋于最大值。超声波预处理时间决定了一定功率下物料吸收超声波能量的大小，超声波预处理时间越长，物料吸收的能量越多，物料越容易被溶胀，纤维素网络结构被破坏的程度就越大，越利于精油的提取，但超声波预处理时间过长会造成能量的浪费。因此，初步确定超声波预处理时间处于70 min左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F004图4时间对出油率的影响2.2响应面试验结果通过软件Design-Expert.8.05，共产生了29组试验方案，按顺序开展试验。响应面试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.T002表2响应面试验结果试验号ABCDY出油率/%10-10-13.17200003.87301-102.6941-1003.12500003.866-11002.84700003.87810103.1890-1013.4210001-13.431110013.1412100-13.0513-10-102.661400-1-13.451510-103.661600-113.1317-10103.7018-1-1003.5019-10013.042011003.2421010-13.532200113.19230-1103.332401103.432500003.862601012.412700003.88280-1-103.2429-100-13.14将预处理条件液料比（A）、pH值（B）、超声波功率（C）、超声波处理时间（D）作为自变量X，沃柑皮精油的出油率作为因变量Y，建立二次多项式回归模型：Y=3.87+0.043A-0.14B+0.12C-0.12D+0.20AB-0.38AC+0.048AD+0.16BC-0.34BD+0.020CD-0.35A2-0.39B2-0.24C2-0.37D2。相关系数（R2）高达0.982，P0.000 1，说明模型拟合效果良好，可应用于对沃柑皮精油提取工艺进行分析。方程各变量方差分析结果，方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值显著性模型3.880140.28014.5700.000 1***A0.02210.0221.1400.303 7B0.22010.22011.7900.004 0*C0.17010.1708.9600.009 7*D0.17010.1709.0900.009 3*AB0.15010.1508.0000.013 4AC0.58010.58030.3900.000 1***AD9.025×10-319.025×10-30.4700.502 1BC0.11010.1105.5600.033 5BD0.47010.47024.6800.000 2**CD1.600×10-311.60×10-30.0840.776 0A20.78010.78040.7700.000 1***B20.98010.98051.7500.000 1***C20.38010.38020.1800.000 5**D20.87010.87045.9400.000 1***残差0.270140.019纯误差2.800×10-447.000×10-5总和4.14028注：“*”表示影响较显著（P0.01），“**”表示影响显著（P0.001），“***”表示影响高度显著（P0.000 1）。由表3可知，回归模型的一次项沃柑皮精油出油率对液料比不敏感，对pH值、超声波功率、超声波处理时间较敏感，二次项A2、B2、C2、D2极显著或高度显著，交互作用项AC、BD高度显著，AC极显著，其余各项不显著。由F值可知，单因素对沃柑皮精油出油率的影响程度排序为BDCA。预处理石灰水液料比、pH值、超声波功率和超声波时间两两之间相互作用对响应值的影响三维图形及等高线投影，各因素交互作用响应面及等高线见图5~图10。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F005图5液料比和pH值对沃柑皮精油出油率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F006图6液料比和功率对沃柑皮精油出油率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F007图7液料比和时间对沃柑皮精油出油率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F008图8pH值和功率对沃柑皮精油出油率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F009图9pH值和时间对沃柑皮精油出油率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.F010图10功率和时间对沃柑皮精油出油率的影响由图5~图10可知，图5、图7、图8、图10中底面的等高线投影的各线条共圆心的趋势明显，表明图中的两因素相互作用较弱。图6、图9中底面的等高线投影的各线条接近椭圆形，表明其中两因素间具有强烈的交互作用。2.3验证试验通过二次多项式回归模型在设定的条件内求最大值，得到使用石灰水、超声波预处理沃柑皮后压榨提取精油的最优条件，即液料比9.69 mL/g、pH值10.91、超声波功率346.31 W、超声处理时间66.78 min，此时沃柑皮精油出油率理论预测值可达3.89%。为通过试验进行验证的便利性，将实际操作条件改为液料比10 mL/g、pH值11、超声波功率320 W、超声处理时间70 min，此条件恰为表2中序号为2、5、7、25、27的4组试验，沃柑皮精油出油率分别为3.87%、3.86%、3.87%、3.86%、3.88%，平均值为3.87%，与理论预测值3.89%接近。因此，可认为利用响应面法得到的工艺可行。2.4沃柑皮精油成分最优条件提取所得沃柑皮精油，经GC-MS分离分析，共确证了48种化合物，含量占总峰面积99.496%，沃柑皮精油化学组分见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.T004表4沃柑皮精油化学组分峰号化合物分子式相对含量1乙酸C2H4O20.3282乙酸乙酯C4H8O20.7643丁内酰酯C4H6O1.0054异戊烷C5H122.4255戊烷C5H121.5326糠醛C5H4O21.4287乳酸乙酯C5H10O30.2828正己醛C6H12O0.78693-己烯-1-醇C6H12O0.145102-己烯-1-醇C6H12O0.92611甲基环己烷C7H140.61712苯甲醛C7H13O0.14813苯甲酸C7H13O20.40614乙酸异戊酯C7H10O20.10015苯甲醇C7H8O0.13516琥珀酸二乙酯C8H14O40.13717辛醛C8H16O0.146182-己氧基乙醇C8H18O20.12719苯乙醇C8H15O0.317203-(2-羟基苯基)丙烯酸C9H13O30.14221壬醛C9H18O0.09822正壬酸C9H18O20.89823甲酸辛酯C9H18O20.43424α-蒎烯C10H160.54925月桂烯C10H162.834续表4　沃柑皮精油化学组分 单位：%%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.012.T005峰号化合物分子式相对含量26β-蒎烯C10H163.41727D-柠檬烯C10H1666.96728(S)-α,α,4-三甲基-1-羟甲基-3-环己烯C10H15O0.10129萜品烯C10H167.09330芳樟醇C10H18O0.36131癸醛C10H20O0.26832柠檬醛C10H16O0.34133紫苏醛C10H14O0.44234α-甜橙醛C10H160.28635α-松油醇C10H18O0.15936香芹酚C10H14O0.30637百里香酚C10H14O0.30638肉桂酸乙酯C11H12O20.142393-苯丙酸乙酯C11H14O20.17940乙酸香叶酯C12H20O20.23741肉桂醛C9H8O0.302421-(2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮C13H18O0.60943十二酸乙酯C14H28O20.22144α-律草烯C15H240.16245γ-榄香烯C15H240.13546十六烷C16H340.37747十七烷C17H360.24848十四甲基环七硅氧烷C14H42O7Si70.128D-柠檬烯在沃柑皮精油中含量最高，达66.967%；萜品烯含量排第2，达7.093%。β-蒎烯、月桂烯、糠醛、丁内酰酯、戊烷和异戊烷含量均大于1%，其余成分含量均在1%以下。通过成分分类分析，发现醇类化合物、醛类化合物、酸类化合物、酯类化合物、烯类化合物、烷类化合物、酚类化合物、酮类化合物的含量分别为2.17%、4.245%、1.774%、3.501%、81.258%、5.327%、0.612%、0.609%。此外，沃柑皮精油中检出了0.306%的百里香酚、0.302%的肉桂醛和0.306%的香芹酚。4结论通过单因素试验和响应面试验优化沃柑皮精油压榨法提取工艺，结果显示，最优条件为液料比10 mL/g、pH值11、超声波功率320 W、处理时间70 min。此条件下采用螺旋式压榨机压榨，沃柑皮精油的出油率可达3.89%，出油率高，试验重现性好。沃柑皮精油微黄、透明，具有浓郁芳香。从沃柑皮精油中检测出48个化合物，其中包含百里香酚、肉桂醛和香芹酚等在畜禽养殖中应用广泛的活性化合物。