盐酸克伦特罗是一种β受体激动剂类药物[1]，临床上多用于治疗哮喘病，因其兼具促进畜禽生长、改善畜禽瘦肉比例等[2-3]功能而应用于畜禽养殖业中。盐酸克伦特罗在畜禽体内残留，人食用畜禽产品后会引起心悸、恶心、高血压、心律失常等症状，严重者甚至导致死亡[4]。因此，我国规定严禁在饲料中添加盐酸克伦特罗。刘文光[5]建立了包括克伦特罗在内的16种β-受体激动剂类药物在猪、牛、羊毛发及尿液中的超高效液相色谱串联质谱的多残留检测方法。周小清等[6]建立了中空纤维膜三相液相微萃取富集浓缩猪尿及牛奶中的痕量盐酸克伦特罗，后续采用高效液相色谱/紫外对其进行定量分析。周珊珊等[7]验证了ELISA方法检测猪尿中克伦特罗残留量的可行性，结果显示，此方法的定性检出限为0.147 μg/L，定量检出限为0.490 μg/L；添加0.5、1.0、5.0 μg/L的克伦特罗标准液的变异系数分别为2.29%、6.97%、2.73%，平均回收率分别为91.8%、102.4%、99.7%。王丽娜等[8]建立了超高效液相色谱-串联质谱法并对克伦特罗在绒山羊体内残留消除规律进行了研究，结果显示，停药40 d后，两试验组残留量均降至10 μg/L以下，肝脏含量约33 μg/kg，肾脏约5 μg/kg，其余组织均未检出。本试验研究了不同给药浓度的盐酸克伦特罗在绒山羊尿液和主要组织中的残留规律，以期为相关研究及畜产品安全监管工作提供参考。1材料与方法1.1试验动物试验从300只健康的辽宁绒山羊群中随机选取66只体重约30 kg、发育正常、中等体况的绒山羊，在辽宁省内某县绒山羊场内饲养。1.2试验材料盐酸克伦特罗粉剂（执法部门办案罚没）。主要仪器：超高效液相色谱-串联质谱仪（waters Quattro premier XE）、高速冷冻离心机（Thermo Fisher 公司）、固相萃取仪（J.T baker公司）、旋转蒸发仪（BUCHI公司）、超纯水器（Millipore公司）、涡旋仪（北京昊诺斯科技有限公司）；恒温振荡器（金坛市中大仪器厂）；分析天平（感量分别为0.01、0.000 1 g）、OA-SYS氮吹仪、PRO250均质器等。主要试剂：甲醇、甲酸、氨水、高氯酸、MCX固相萃取小柱等。1.3试验设计66只试验绒山羊中随机抽取6只作为对照组，其余60只随机分为A组和B组，每组设10个重复，每个重复3只。每个重复编号与绒山羊的耳标号相对应。各组均为常规方式圈养,饲喂配合日粮，自由饮水。对照组饲喂不含盐酸克伦特罗的日粮，自由采食；A组每日15：00饲喂添加150 μg/kg·BW盐酸克伦特罗的日粮，B组饲喂添加300 μg/kg·BW盐酸克伦特罗的日粮，两试验组均在饲喂添加盐酸克伦特罗日粮前停食3 h，保证绒山羊将含药日粮全部吃下，连续给药25 d后停药。停药后饲喂正常日粮。试验共60 d，分为两阶段：第一阶段为给药期25 d，第二阶段为停药期35 d。1.4试验方法本试验中尿液及各组织样本中盐酸克伦特罗含量的检测，均采用超高效液相色谱-串联质谱法[9-10]。1.4.1尿液采集于饲喂盐酸克伦特罗24 h后，A组、B组各随机选取6只绒山羊，整个试验期内每天采集尿液进行盐酸克伦特罗检测；对照组6只绒山羊全部采集尿液，进行盐酸克伦特罗检测，不足6只时全部采集。1.4.2组织样品采集分别在停药的第1、3、5、7、10、15、20、25、30、35 d，于A组和B组中各随机选取3只绒山羊宰杀，取肝脏、肺脏、肾脏、肌肉等4种组织样品，每种组织采样量250 g左右，对肝脏、肺脏、肾脏、肌肉中盐酸克仑特罗残留进行检测。2结果与分析2.1给药阶段盐酸克伦特罗在绒山羊尿液中的残留浓度（见表1）给药阶段同时检测对照组绒山羊，结果显示，对照组绒山羊尿液均未检出盐酸克伦特罗残留。由表1可知，A组和B组均在饲喂24 h内于尿液中检测到盐酸克伦特罗。随着饲喂天数增加，盐酸克伦特罗在绒山羊体内的不断地吸收和代谢，绒山羊体内盐酸克伦特罗残留量随之增加，盐酸克伦特罗在尿液中的检出浓度呈逐渐上升的趋势。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.004.T001表1饲喂阶段盐酸克伦特罗在绒山羊尿液中的残留浓度Tab.1Residual concentration of clenbuterol hydrochloride in cashmere goat urine during administration给药时间/dA组B组给药时间/dA组B组12931 332141 9904 71526672 317153 6035 02634062 485161 6172 56642982 526171 6163 24959831 371181 6933 61862 2671 994191 9122 60072 7451 273202 7283 38183 5627 878213 8683 51493 23911 487223 7106 889105 3245 680233 6704 928111 6035 583242 1035 031121 6635 806252 4621 928131 8015 464μg/LA组在饲喂药物后第10 d，尿液中盐酸克伦特罗浓度达到第一次峰值为5 324 μg/L，之后呈较平稳的态势；在饲喂后第21 d出现第二次峰值，为3 868 μg/L。B组在给药24 h内尿液中盐酸克伦特罗浓度即达到1 332 μg/L；饲喂后第9 d，尿液中浓度达到第一次峰值，为1 1487 μg/L；之后尿液中盐酸克伦特罗浓度也呈较平稳的变化趋势，于饲喂后第22 d出现第二次峰值6 889 μg/L，之后尿液中盐酸克伦特罗的浓度逐渐降低。2.2停药阶段盐酸克伦特罗在绒山羊尿液中的残留浓度（见表2）停药后35 d内每天检测对照组绒山羊尿液中盐酸克伦特罗残留的浓度，结果显示仍未检出。由表2可知，停药后，两试验组绒山羊尿液中残留的盐酸克伦特罗浓度持续降低，至第35 d后，A组残留浓度约6 μg/L，B组残留浓度约9 μg/L。同一时间点A组中出现个别盐酸克伦特罗残留浓度大于B组,应由绒山羊个体差异和采食不均导致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.004.T002表2停药阶段盐酸克伦特罗在绒山羊尿液中的残留浓度Tab.2Residual concentration of clenbuterol in cashmere goat urine during drug withdrawal停药时间/dA组B组停药时间/dA组B组111659919191829719720182439386212417470832224245515223161365960241222722442526128436426171393244272124103739281913113340291412121833302217132640312381418333212141516273361016382134661733183569182925μg/L2.3停药阶段盐酸克伦特罗在绒山羊不同组织中的残留浓度（见表3）停药后第1、35 d，对照组各宰杀3只绒山羊，采集肝脏、肺脏、肾脏、肌肉4种组织，进行盐酸克伦特罗残留检测。结果显示，对照组绒山羊的4种组织中均未检出盐酸克伦特罗。由表3可知，停药后第30 d，两试验组绒山羊肝脏中仍可检出盐酸克伦特罗残留，B组肌肉中检出量为2 μg/kg；停药后第35 d，两试验组绒山羊除肝脏中仍可检出盐酸克伦特罗残留外，其他组织残留浓度均为0。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.09.004.T003表3停药阶段盐酸克伦特罗在绒山羊不同组织中的残留浓度Tab.3Residual concentrations of clenbuterol in different tissues of cashmere goats during drug withdrawal停药时间/dA组B组肝脏肾脏肺脏肌肉肝脏肾脏肺脏肌肉11 033549233521 6898626159135819491111 0451201092453924852561192542273743661133716437101025222102282374181512498213310165209572391819425921092848105307300055002353200036000μg/kg3讨论3.1尿液中盐酸克伦特罗消长规律本研究中，饲喂盐酸克伦特罗后24 h后，A组、B组绒山羊尿液中均即可检出盐酸克伦特罗残留。在给药阶段，两组绒山羊尿液中盐酸克伦特罗浓度始终保持在较高水平；停药后盐酸克伦特罗残留浓度随时间推移呈逐渐下降趋势，但消除速度缓慢，停药35 d后尿液中仍可检出。结果表明，活体采集尿液监测是一种有效的监管手段。本研究在绒山羊尿液中检测到高浓度的盐酸克伦特罗残留，表明尿液是盐酸克伦特罗排泄的主要途径[11]，绒山羊体内吸收的盐酸克伦特罗浓度越高，尿液中排出的盐酸克伦特罗残留量越高。饲喂开始后，盐酸克伦特罗在体内开始吸收、分布、代谢、排泄。第一个峰值出现是由于盐酸克伦特罗吸收出现饱和，大量盐酸克伦特罗排泄到尿液中；随后β-受体数量和结合位点增多，产生应激现象，使尿液中盐酸克伦特罗浓度降低。第二个峰值出现是由于组织中盐酸克伦特罗开始排泄，大量盐酸克伦特罗直接排泄到尿液中。此外，重复多次饲喂盐酸克伦特罗可在绒山羊体内造成蓄积，导致给药第25 d后，尿液中盐酸克伦特罗的残留量高于喂药后第1 d的残留量。3.2盐酸克伦特罗在组织中消除规律本试验结果表明，肝脏是绒山羊盐酸克伦特罗残留浓度最高的组织，其残留量显著高于肾脏、肺脏和肌肉组织。在停药阶段，4种组织中的盐酸克伦特罗残留浓度均呈下降趋势，其中肾脏、肺脏和肌肉的残留浓度下降很快，肝脏中盐酸克伦特罗代谢较慢，至试验结束时仍可检出。受试验条件限制，本研究未能测试出停饲盐酸克伦特罗后什么时间可在绒山羊体内代谢完全，仍有待进一步研究。此外，有研究表明，盐酸克伦特罗在眼睛中蓄积量最大[12]，但在实际工作中，监管采样环节采集眼睛样本比较困难，故主要将肝脏作为监管检测的靶组织。4结论本试验结果表明，饲喂含不同浓度盐酸克伦特罗的日粮1 d后均可在尿液中检测到盐酸克伦特罗残留；饲喂25 d及停药后1 d，在肝脏、肾脏、肺脏、肌肉4种组织中均可检出盐酸克伦特罗残留。各组织中盐酸克伦特罗残留量差异显著，以肝脏中含量最高，肌肉中含量最低。盐酸克伦特罗在4种组织中消除的速度各不相同，在停药第30 d后，两试验组肾脏、肺脏和肌肉中盐酸克伦特罗残留浓度基本降至0，肝脏中仍有较高浓度残留。4种组织中，盐酸克伦特罗在肝脏中消除最慢。因此，肝脏可作为监管监测的靶组织。