新疆畜牧养殖发展基础雄厚，肉牛产业规模持续扩大。在此背景下，集约规模化养殖产业不断发展，尤其是以“万头牛场”为重点的牛产业。引进牛群是扩大肉牛养殖规模的有效方法之一，包括引进犊牛、青年牛、妊娠母牛等。其中妊娠母牛是首选，可在短时间内提高牛群数量。目前新疆各区域主要从内蒙古、宁夏、甘肃、青海以及新疆其他地区引进牛。近年来，全球养殖场频发引进牛群导致家畜疫病暴发的案例，如结节性皮肤病、巴氏杆菌病、蜱虫病等[1-3]。引进牛经过严格隔离、检疫条件下开展运输工作，但部分无须检疫的病原体可能通过体内、外途径在当地养殖区域传播，加大了兽医治疗工作量。养殖场最常见的疾病为大肠杆菌病，是病因复杂、继发病最多的消化道疾病之一。其中产志贺毒素大肠杆菌（STEC）引起的腹泻病较严重，传染源主要为病牛和带菌牛。STEC包括志贺毒素（stx1、stx2）、黏附因子（eae）、溶血素（hlyA）等毒力因子，在发病、发展过程中起到主要致病作用，可通过垂直、水平传播方式对畜牧养殖场长期发展造成威胁[4]。据文献报道，STEC中70%由非O157血清群引起，包括O26（22%）、O45（7%）、O103（12%）、O111（16%）、O121（8%）、O145（5%）等6种血清型，被世界公共卫生部门称为‘the big six’[5]。本试验采用PCR方法检测STEC相关毒力因子stx1、stx2、eae、hlyA等以及‘the big six’血清型O26、O45、O103、O111、O121、O145的分布情况，对新疆部分地区引起妊娠母牛肠道致病性大肠杆菌进行风险评估，为新疆“万头牛场”健康发展提供参考。1材料与方法1.1样品采集某区养殖场采集腹泻症状妊娠母牛新鲜粪样品共计160份，4 ℃冷藏，迅速带回实验室开展菌株分离、纯化、保存工作。1.2试验材料参考菌株O157:H7由新疆农业大学动物医学学院苏占强教授提供。主要试剂：营养肉汤、营养琼脂、麦康凯、伊红美蓝等培养基（奥博星生物技术有限公司）；Taq Master Mix、DNA Marker 2000、琼脂糖、EZ-Vision DNA染料（天根生物有限公司）。主要仪器：T100梯度PCR仪、凝胶成像仪系统（BIO-RAD）；高速离心机（Eppendorf）、DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）；常规耗材由新疆农业大学新疆草食动物新药研究与创制重点实验室提供。1.3PCR鉴定PCR检测相关反应引物、反应条件按照参考文献[6-12]，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.001.T001表1PCR引物序列和目的片段Tab.1PCR primer sequence and product length基因引物序列(5'→3')条带大小/bpuspA -FATC CTG GCT CAG ATT GAA CGC T1 439[6]uspA -RTAC AAG GCC CGG GAA CGT ATT CAstx1-FTGT CGC ATA GTG GAA CCT CA655[7]stx1-RTGC GCA CTG AGA AGA AGA GAstx2-FCCA TGA CAA CGG ACA GCA GTT477[7]stx2-RTGT CGC CGA TTA TCT GAC ATT Ceae-FATT ACC ATC CAC ACA GAC GGT375[7]eae-RACA GCG TGG TTG GAT CAA CCThlyA-FAGC CGG AAC AGT TCT CTC AG526[8]hlyA-RCCA GCA TAA CAG CCG ATG TrfbE-FGTG TCC ATT TAT ACG GAC ATC CAT G292[9]rfbE -RCCT ATA ACG TCA TGC CAA TAT TGC CfliC-FGCG CTG TCG AGT TCT ATC GAG C625[9]fliC-RCAA CGG TGA CTT ATC GCC ATT CCO26-FGTG TGT CTG GTT CGT ATT TTT TAT CTG155[10]O26-RCCT TAT ATC CCA ATA TAG TAC CCA CCC续表1　PCR引物序列和目的片段(Continued)Tab.1　PCR primer sequence and product lengthXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.001.T002基因引物序列(5'→3')条带大小/bpO45-FGGT CGA TAA CTG GTA TGC AAT ATG238[11]O45-RCTA GGC AGA AAG CTA TCA ACC ACO103-FTTA TAC AAA TGG CGT GGA TTG GAG321[10]O103-RTGC AGA CAC ATG AAA AGT TGA TGCO111-FTTC GAT GTT GCG AGG AAT AAT TC438[11]O111-RGTG AGA GCC CAC CAG TTA ATT GAA GO121-FAGT GGG GAA GGG CGT TAC TTA TC514[12]O121-RCAA TGA GTG CAG GCA AAA TGG AGO145-FCCT GTC TGT TGC TTC AGC CCT TT750[12]O145-RCTG TGC GCG AAC CAC TGC TAA T2结果与分析2.1分子生物学鉴定结果本试验共采集粪便样品160份，采用生化方法筛查、PCR方法进行大肠菌株分离，结果扩增出1 439 bp的目的基因条带，符合判定结果，最终共分离出阳性菌株160份（100%）。部分样品鉴定结果见图1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.001.F001图1部分样品分子生物学鉴定结果Fig.1Molecular biology identification results of some samples注 ： M为D2000 DNA Marker；1~19为被检样品；+为标准阳性大肠杆菌；-为阴性对照组；下图同。2.2编码毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA的检测结果采用标准菌株作为阳性模板检测毒力基因，结果扩增出目的条带stx1（655 bp）、stx2（477 bp）、eae（375 bp）、hlyA（526 bp）。部分样品鉴定结果见图2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.001.F002图2部分样品STEC毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA检测结果Fig.2STEC virulence gene stx1、stx2、eae、hlyA detection results of some samples2.3‘the big six’血清型检测结果（见图3）参考文献方法对阳性菌株进行‘the big six’O26、O45、O103、O111、O121、O145、O157血清型检测工作，扩增出目的条带O157（895 bp）、O145（750 bp）、O121（628 bp）。部分样品STEC大肠杆菌‘the big six’血清型检测结果见图3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.001.F003图3部分样品STEC大肠杆菌‘the big six’血清型检测结果Fig.3STEC E. coli 'the big six' serotype test results for some samples注 ： M为D2000 DNA Marker；1~23为被检基因样品；-为阴性对照组。2.4STEC相关毒力基因、‘the big six’血清型检测结果160株阳性菌株中stx1、stx2、eae、hlyA分离较高（63.13%，101/160），检出率分别为13.13%（21/160）、16.88%（27/160）、23.13%（37/160）、10.00%（16/160）。统计分析共携带12种毒力基因谱，以eae（11.25%，18/160）为主，其次为stx2+eae（7.50%，12/160）、hlyA（5.00%，8/160）、stx1+stx2（3.75%，6/160）。‘the big six’血清型检测共分离到3种血清型，其中O145检出率最高（4.38%，7/160），其次为O157（1.88%，3/160）、O121（0.63%，1/160）。3讨论“万头牛场”规模化养殖区逐渐扩大，必然通过引进牛措施达到规模。被引进的牛群体内、外致病菌可能在一定范围的区域内感染当地牛群，引发消化道、呼吸道疾病等；高致病性病原体还可能引起妊娠母牛发生流产、死胎等现象。垂直、水平传播方式感染幼畜引起发病和死亡也可对当地牛群健康造成极大威胁，也对当地食源性疾病的暴发造成一定风险。STEC是重要的食源性致病菌之一，可产生stx1、stx2、eae、hlyA。研究发现，stx1可引起腹泻，stx2主要引起溶血性尿毒综合征（肾病）、肠炎、血小板减少性紫癜、神经系统病变等疾病[13-14]。hlyA引起肠外疾病，诱导产生促进炎症细胞因子。eae可引起人肠上皮细胞产生附着、抹平损伤[15-16]。研究表明，STEC非O157血清型可引起人、家畜共患病传播，其中牛是重要储存宿主[17-18]。由于牛消化系统缺乏志贺毒素受体，故STEC对高免疫牛群健康影响较小，但对幼畜牛群消化系统功能影响较大。研究表明，stx能够对牛肠道细胞作出一定的反应，但与人类的敏感细胞类型对比，stx对牛肠道细胞只具有调节作用，不产生致命影响[16,18]。由于STEC爆发主要通过食物链发生，为防治感染致泻性病原体必须在食物链阶段采取干预措施，首先在动物、牧群层面进行，其次在屠宰场、肉类、奶牛加工厂。此外，食用生肉、未煮熟的肉类以及未经巴氏消毒奶产品也存在一定感染风险，2013年我国《食品安全国家标准食品中致病菌限量》部分内容增加了STEC O157:H7限量标准，以提高食品安全质量[19-21]。本研究结果显示，阳性菌株分离编码毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA分离率达63.13%。分析存在12种毒力基因谱（45.63%，73/160），检出率已达到总样品1/3，以eae（11.25%，18/160）为主，其次为stx2+eae（7.50%，12/160）、hlyA（5.00%，8/160）、stx1+stx2（3.75%，6/160），推测引进牛肠道致病菌具有一定的传播风险。有文献报道，具有stx1的STEC菌株更适合在哺乳犊牛中定居，而具有stx2的菌株在断奶犊牛和成年牛中占主导地位[21-23]。本试验中stx2分离率为16.88%（27/160），与该结论一致。‘the big six’血清型STEC可随动物粪便排出体外，存在污染动物性食品致人类感染的风险。不同国家、不同区域血清型分布不同，如O111在巴西、O103在瑞士常见。美国报道O26、O111的爆发与牛源食品有关，且O26与人类致病性大肠杆菌暴发疾病最相关[24-26]。张凌[27]报道新疆某腹泻牛群中O145、O22、O179为优势血清型；张陆等[28]报道哈尔滨部分腹泻牛群O26、O78、O15为优势血清型；吴孟等[29]报道腹泻牛群O78、O111为优势血清型。本试验共分离出3种‘the big six’血清型，其中O145检出率最高（4.38%），为引进妊娠母牛优势血清型；分离出3株O157血清型（1.88%）。O157为人畜共患病之一，应关注兽医养殖人员、幼畜动物健康动态，防止疾病暴发。妊娠母牛产犊后护理不当容易引起乳房炎，其中细菌感染引发乳房感染率较高。Sayed[30]从奶牛乳房炎病理样品中分离出STEC，占总样品数的39.9%。Galal等[31]从腹泻犊牛、临床和亚临床乳腺炎奶牛病理样品中分离出O111、O26。本试验未采集乳房、乳汁样品，应关注母牛产后护理、检测工作，防止外来新型致病菌株引发乳房炎。林亚军等[32]对新疆地区和新引进牛大肠菌株耐药率进行对比，结果发现，新引进牛对氟苯尼考、庆大霉素、安普霉素、阿莫西林和氨苄西林的中度敏感率显著高于新疆地区牛，可能导致耐药率短期内迅速增高。因此建议当地兽医部门针对引进牛细菌病原学检测工作，以便兽医人员筛选最佳临床兽用抗菌药品，降低耐药率，提高养殖场经济效益。4结论本研究结果表明，新疆某区引进妊娠母牛肠道存在产志贺毒素大肠杆菌及强致腹泻血清型大肠杆菌。因此，兽医人员有必要关注群发性消化道疾病症状，防止外源致病菌的传播。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.001.F004