我国蛋白饲料资源相对紧缺，鱼粉、豆粕等蛋白饲料原料价格高涨。为节约成本，生产中常通过添加廉价糖类替代蛋白质和脂质的供能[1]，饲喂高糖饵料的团头鲂会出现脂肪肝现象[2-4]。氧化三甲胺（TMAO）是许多水生生物的天然组分，也是甜菜碱、胆碱等经肠道微生物和肝脏黄素含单氧酶3（FMO3）作用后的代谢产物[5]。TMAO是一种新型的水产动物诱食剂，可通过刺激水产动物的嗅觉器官提高水产动物神经兴奋性[6]。TMAO能够调节渗透压，稳定蛋白质结构，以小分子伴侣发挥作用。TMAO还能够影响脂质吸收和胆固醇平衡，调节糖脂代谢[7]。研究发现，TMAO是非酒精性脂肪肝（NAFLD）的风险标志物，TMAO的血循环水平与NAFLD存在正相关关系[8-10]；日粮中添加一定量的TMAO会降低鱼类肝脏和肌肉的脂肪含量[11-13]。因此，推测外源添加TMAO与内源血循环中的TMAO对机体的作用效果不同。本试验以团头鲂为研究对象，探究高糖日粮中添加TMAO对团头鲂生长、体成分、肝脏健康、机体各组织与血循环中TMAO及其相关代谢产物的影响，以期为寻找和应用耐高糖饵料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验鱼苗购自湖北省武汉市黄陂区鑫鳜源生态农业科技有限公司苗种繁殖基地。氧化三甲胺购自广东康达生物科技有限公司，纯度≥98%。1.2试验设计选取270尾体重（5.00±0.50）g、体格健壮的团头鲂，随机分为3组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。对照组（CD组）团头鲂投喂基础饵料，高糖组（HCD组）团头鲂投喂总糖量为38.25%的饵料，高糖+0.2% TMAO组（HTD组）团头鲂投喂总糖量为38.25%加0.2% TMAO的饵料。设置3组等氮、等脂饵料，以30尾/缸的密度随机分布在9个塑料养殖缸（300 L）中。试验饵料组成及营养水平见表1。驯养2 w开始养殖试验，正式试验期90 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.T001表1试验饵料组成及营养水平项目CD组HCD组HTD组原料组成鱼粉11.0011.0011.00大豆粕29.6024.0024.00棉粕5.005.005.00菜粕15.0015.0015.00次粉19.0033.0033.00麦麸5.005.005.00豆油2.002.002.00赖氨酸0.300.300.30蛋氨酸0.100.100.10磷酸二氢钙1.001.001.00氯化胆碱0.200.200.20羧甲基纤维素1.001.001.00预混料1.001.001.00氧化三甲胺000.20沸石粉9.801.401.20合计100.00100.00100.00营养水平粗蛋白30.05±0.1830.44±1.1930.05±0.85粗脂肪11.58±0.3911.23±0.8511.51±0.55总糖28.59±0.2838.25±0.2238.23±0.20粗灰分16.88±0.048.89±0.018.57±0.05水分10.06±0.028.77±0.269.10±0.10注：1.预混料购自北京渔经生物科技有限公司。2.营养水平均为实测值。%试验饵料制备：将各种原料粉碎，过60目筛，称重，按配方比例混合，制粒晾干，-20 ℃保存。1.3饲养管理团头鲂在养殖缸驯化2 w开始投喂试验饵料，每日投喂2次，日投饵量为鱼体重的2%~4%，根据鱼的摄食情况以及生长状况及时调整，水温保持在24~26 ℃，pH值7.2~7.8，溶解氧大于5 mg/L，氨氮小于0.1 mg/L，试验期间保持养殖场安静。1.4样品采集试验鱼饥饿12 h后麻醉，从每缸中随机选取15尾鱼测定体重，采用尾静脉抽血法获得血液，制备为血清，液氮速冻后-80 ℃保存。采血后解剖试验鱼，取内脏称重，分离肝脏称重，分成两份，一份在10%甲醛固定液中固定保存；另一份经液氮速冻置于-80 ℃保存，并分离出肠道、肾脏和背部肌肉，液氮速冻后-80 ℃保存。未解剖全鱼-20 ℃保存，用于体成分分析。1.5测定指标及方法1.5.1生长性能试验鱼称重，测定体长，按照下列公式计算试验团头鲂的生长性能指标。体增重=100%×(末重-初重)/初重（1）特定生长率=100%×(ln末重-ln初重)/饲养天数（2）饵料系数=投喂饵料总量/鱼体总增重（3）肥满度=100×体重/体长3 （4）脏体比=100%×内脏重/鱼体重(5)肝体比=100%×肝脏湿重/体湿重（6）1.5.2饵料常规营养水平和体成分测定水分、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪含量的测定方法参照文献[14]。饵料中总糖含量的测定参照DB12/T 847—2018分光光度法。1.5.3肝脏H&E和油红O切片分析肝脏H&E切片分析：将固定的肝组织制成石蜡切片，分别进行苏木素染色和伊红（H&E）染色，切片脱水后使用甘油明胶封片得到染色切片，将H&E染色切片置于显微镜，在200×视野下观察肝细胞的形态和拍照。肝脏油红O切片：制得冰冻切片，晾干，使用油红染液染色，待分化至间质清晰后进行苏木素复染，经过分化和返蓝，使用甘油明胶封片得到油红O染色切片，将染色切片处于置于200×视野下，观察脂滴情况，拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 软件分析切片视野的积分光密度（IOD）。1.5.4组织中代谢产物含量血清、肝脏、肠道、肾脏、肌肉中的TMAO、三甲胺（TMA）、二甲胺（DMA）代谢物含量由北京质谱医学研究公司通过HPLC-MS/MS Ultimate3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）测定。具体方法为：取50 μL血清，加入150 μL蛋白沉淀剂（甲醇∶乙腈为1∶4，含褪黑素-D4 200 μg/L），涡旋1 min，静置5 min，4 ℃、13 200 r/min离心4 min，取上清液作为待测液。称量适量肠道、肝脏、肌肉、肾脏组织，加蒸馏水，匀浆，制得组织匀浆液，按照血清待测液制备方法，分别制得肝脏、肠道、肾脏和肌肉待测液。将待测液放于HPLC-MS/MS系统进行分析，参照徐佳[15]操作进行后续测定和数据分析。1.6数据统计与分析采用GraphPad Prism 8软件进行单因素方差分析，最小显著差异法（LSD）进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1高糖饵料添加TMAO对团头鲂生长性能的影响（见表2）由表2可知，HCD组团头鲂的增重率和特定生长率显著低于CD组和HTD组（P0.05），HCD组团头鲂的肝体比显著高于CD组和HTD组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.T002表2高糖饵料添加TMAO对团头鲂生长性能的影响组别CD组HCD组HTD组增重率/%191.27±3.01a162.91±3.79b184.94±6.40a特定生长率/(%/d)1.18±0.01a1.07±0.02b1.15±0.02a饵料系数2.17±0.052.35±0.282.24±0.66肥满度/(g/cm3)2.11±0.102.16±0.042.14±0.20脏体比/%8.00±0.168.52±0.428.18±0.28肝体比/%1.51±0.06b1.70±0.06a1.53±0.03b注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.2高糖饵料添加TMAO对团头鲂体成分的影响（见表3）由表3可知，与CD组相比，HCD组团头鲂的粗脂肪含量显著升高（P0.05）。HTD组团头鲂粗脂肪含量显著低于HCD组（P0.05)。各组团头鲂的粗蛋白、粗灰分及水分含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.T003表3高糖饵料添加TMAO对团头鲂体成分的影响组别粗蛋白粗灰分水分粗脂肪CD组16.09±0.793.21±0.0668.38±0.7812.02±0.34bHCD组16.51±0.143.25±0.1666.77±0.1113.29±0.31aHTD组16.56±0.623.47±0.0367.05±0.6612.22±0.33b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%2.3高糖饵料添加TMAO对团头鲂肝脏组织的影响（见图1~图3）由图1可知，与CD组相比，HCD组团头鲂较多肝细胞的细胞膜破裂，肝细胞核不规则、发生偏移甚至消失，较多肝细胞肿大，出现脂肪堆积，肝细胞内空泡未染色区域较多；与HCD组相比，HTD组团头鲂肝细胞状态则发生明显改善，肝细胞内脂肪堆积减少，细胞形态逐渐恢复正常。图1肝脏组织的H&E染色结果（200×）注：a为肝细胞核形状规则；b为肝细胞核形状不规则；c为肝细胞肿大且细胞内脂肪堆积；d为肝细胞缺失细胞核。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F1a1（a）CD组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F1a2（b）HCD组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F1a3（c）HTD组由图2、图3可知，与CD组相比，HCD组团头鲂的肝细胞中脂肪堆积严重，且IOD极显著升高（P0.01）；而HTD组团头鲂的IOD值极显著低于HCD组（P0.01），极显著高于CD组（P0.01）。表明日粮添加TMAO能够显著改善高糖导致的鱼体肝脂沉积和肝细胞健康状态。图2肝脏组织的油红O染色结果（200×）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F2a1（a）CD组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F2a2（b）HCD组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F2a3（c）HTD组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.F003图3高糖饵料添加TMAO对团头鲂肝脏组织IOD值的影响注：“**”表示差异极显著（P0.01）。2.4高糖饵料添加TMAO对团头鲂组织中代谢产物含量的影响（见表4）由表4可知，与CD组相比，HCD组团头鲂血清TMAO含量显著上升（P0.05），DMA含量显著降低（P0.05）；与HCD组相比，HTD组团头鲂血清TMAO含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.013.T004表4高糖饵料添加TMAO对团头鲂组织中代谢产物含量的影响项目CD组HCD组HTD组血清/(μg/L)TMAO0.24±0.02b1.53±0.28a0.74±0.08bTMA2 565.00±63.642 485.00±77.782 370.00±0.00DMA16.80±0.85a6.20±0.12b8.47±0.51b肝脏/(μg/g)TMAO0.006 1±0.000 10.004 5±0.000 00.006 3±0.001 0TMA31.80±2.40c47.05±1.34b62.70±5.37aDMA0.03±0.020.02±0.000.03±0.01肠道/(μg/g)TMAO0.014±0.0030.013±0.0010.011±0.001TMA74.65±18.0384.60±4.3880.45±2.05DMA0.13±0.01a0.05±0.01b0.06±0.01b肾脏/(μg/g)TMAO0.003 5±0.002 1b0.016 9±0.002 3a0.006 0±0.000 9bTMA31.15±3.1839.45±10.1147.65±0.07DMA0.027±0.005b0.011±0.000b0.245±0.060a肌肉/(μg/g)TMAO0.002 3±0.000 00.002 2±0.000 10.002 9±0.000 3TMA34.20±2.26a21.90±1.27b26.55±0.78bDMA0.151±0.008a0.049±0.000b0.138±0.007a与CD组相比，HCD组团头鲂肝脏TMA含量显著上升（P0.05）；与HCD组相比，HTD组团头鲂肝脏TMA含量显著上升（P0.05）。与CD组相比，HCD组及HTD组团头鲂的肠道DMA含量均显著降低（P0.05）。与CD组相比，HCD组团头鲂肾脏TMAO含量显著上升（P0.05）；与HCD组相比，HTD组团头鲂肾脏TMAO含量显著降低（P0.05），肾脏DMA含量显著上升（P0.05）。与CD组相比，HCD组团头鲂肌肉TMA和DMA含量显著降低（P0.05），HTD组团头鲂肌肉TMA含量显著降低（P0.05）；与HCD组相比，HTD组团头鲂肌肉中DMA含量显著上升（P0.05）。3讨论3.1高糖饵料添加TMAO对团头鲂生长性能的影响饵料中添加一定量的TMAO对红鲫鱼、三角鲂、罗非鱼和南美白对虾均具有良好的诱食和促摄食作用，能够显著提高水产动物的生长性能[11,13,16-17]。研究发现，饵料中添加TMAO能够提高罗非鱼的摄食率和生长性能，且适宜添加量为0.2%。在饵料中添加0.2% TMAO可显著提高哲罗鲑的摄食率和生长性能[18]。本研究中，与高糖组相比，0.2% TMAO添加组团头鲂的增重率和特定生长率显著增加，饵料系数和肥满度差异不显著。但饵料中TMAO的添加量不同，水产动物的诱食效果和生长性状也不同[19]。饵料中添加1.0~2.5 g/kg TMAO，红鲫鱼幼鱼的促生长性能随TMAO添加量的增加而升高；但添加量超过2 g/kg后，红鲫鱼幼鱼的生长速度出现减慢[16]。因此，TMAO对鱼类生长性能的影响并无统一结论，可能与物种和添加剂量有关。3.2高糖饵料添加TMAO对团头鲂鱼体成分的影响高糖饵料能够导致团头鲂全鱼粗脂肪含量显著升高[4]，而饵料中添加一定量的TMAO能够显著降低罗非鱼肌肉和肝脏中的脂肪含量[11]。在虹鳟和三角鲂的研究中也发现TMAO具有降脂效果[12-13]。本研究中，高糖饵料能够增加团头鲂体脂肪含量，添加TMAO后，团头鲂体粗脂肪含量显著降低，与上述研究结果一致。除鱼类外，在畜禽中也有类似报道，如日粮中添加TMAO可使生长肥育猪的脂肪率降低18.4%，原因是TMAO可提高机体内血清生长激素（GH）水平，降低胰岛素水平下。而血清GH含量升高可以减少机体的体脂肪沉积，胰岛素水平下降则导致脂肪合成降低和分解作用增强，也起到了减少体脂肪沉积的作用[20]。因此，饵料添加TMAO能够减少脂肪在鱼体中的沉积，降低鱼体粗脂肪含量。3.3高糖饵料添加TMAO对团头鲂肝脏健康的影响显微镜肝脏的形态结构能够反映鱼类肝脏的健康状况[21]。正常肝细胞的细胞核大而圆，且位于肝细胞中央，细胞内有少量的脂肪滴[22]。长期摄入高糖会影响鱼类肝胆健康，造成脂肪肝病[23-24]，鱼类肝细胞内出现大空泡、脂肪滴大量聚集，细胞膜破裂、细胞核发生偏移或消失[22]。本试验中，HCD组团头鲂也发生了高糖导致的上述肝细胞变化，且肝体比和IOD值也表明HCD组的肝脂含量显著增加；但与HCD组相比，HTD组团头鲂的肝细胞健康状态、肝脏脂肪含量均得到显著改善，与孙海香等[11]研究结果一致。因此，高糖饵料添加TMAO能够显著改善高糖导致的鱼体肝脂沉积和肝细胞健康状态。3.4高糖饵料添加TMAO对团头鲂各组织中相关代谢产物含量的影响Randrianarisoa等[25]与Tan等[26]研究发现，血液TMAO水平与肝脏脂肪含量呈正相关。本试验中，与高糖组相比，添加TMAO后团头鲂血清TMAO含量显著降低，与本研究中高糖饵料添加TMAO能够显著改善高糖导致的鱼体肝脂沉积和肝细胞健康状态的结论相符。日粮中添加某种物质或养分，动物血循环水平往往升高。本试验中，高糖饵料添加TMAO后，团头鲂血循环水平下降，原因可能与TMAO自身的性质、功能及其在动物体内的来源与去路有关。动物体内的TMAO来源主要有两种，一是从食物直接摄取，包括浮游植物、鱼、贝、日粮添加TMAO等；二是自身生物合成，即食物中的前体（如甜菜碱、胆碱、肉碱等）[7,27]经过肠道微生物的作用生成TMA[28]，再经过肝脏的FMO3氧化成TMAO[5,9,27]。本试验中，CD组和HCD组团头鲂食物摄取的TMAO相同，而HTD组TMAO含量高于其他组。摄入体内的TMAO经肠道微生物降解成TMA，经血液进入肝脏。本试验中，HTD组团头鲂肝脏TMA含量显著升高，但各组间团头鲂血液和肠道TMA水平差异不显著，与上述研究结论一致。研究发现，高糖摄入使与TMA的产生有关的肠道微生物、血液TMA及肝脏FMO3的基因表达均显著增加[12,29]，表明日粮-肠道微生物-TMA-FMO3-TMAO通路会影响肠道、血液及肝脏的TMAO含量，与本试验结果一致。但本试验中，各组团头鲂肠道及肝脏的TMAO含量无明显差异，而且HTD组团头鲂血液TMAO含量显著低于HCD组，原因可能与TMAO是渗透压调节剂的功能有关。由于TMAO是渗透压调节物，机体为维持渗透压平衡，TMAO会恒定在一定水平。为维持这种稳定，当日粮摄入量增加导致机体TMAO含量增加时，机体将加大其排出量以维持渗透压平衡。而TMAO在动物体内的排出路径有肌肉、肾脏及肠道，肝脏TMAO经血液循环到达肌肉、肾脏和肠道，但优先分布于肌肉中，其中肌肉和肠道的部分TMAO可经还原酶（TorA）作用生成TMA[30]，肾脏和肌肉中的TMAO还可在TMAO脱甲基酶（TMAOase）作用下生成二甲胺（DMA）和甲醛（FA）[31-32]，而肾脏剩余的TMAO经尿液排出体外。本试验中，与HCD组相比，HTD组团头鲂肾脏和肌肉的DMA含量显著增加，肾脏TMAO含量显著降低，而在肌肉、肾脏和肠道的TMA含量没有变化，表明饵料添加的TMAO主要在肾脏和肌肉经TMAOase作用后生成DMA排出体外，高糖组的TMAO主要经肾脏的尿液排出体外。4结论在高糖饵料中添加0.2% TMAO能够促进团头鲂生长，显著降低团头鲂机体粗脂肪含量和肝体比指数，改善肝脏健康状况，通过加强TMAO在肾脏和肌肉中的降解与排泄减少血清中TMAO的含量，进而降低肝脂含量。