与传统的抗生素相比，中草药饲料添加剂具有多成分、多靶点、与机体多系统相互作用等特点[1]。中草药作为饲料添加剂能够提高动物生产性能，预防疾病[2-3]。四君子汤为补脾益气的典型代表方剂，由人参、炒白术、茯苓、炙甘草4味中草药组成[4]。四君子汤中的化学成分主要有黄酮、多糖和皂苷类[5]。四君子汤主要通过调节胃肠功能提高机体免疫力而发挥补中益气作用，具有健脾开胃、抗疲劳、耐缺氧、补血活血及增强记忆力等功效[6-7]。近年来，微生物发酵中药作为中药炮制的特殊方式受到众多学者的关注。发酵一般有固体发酵和液体发酵两种形式，不同菌种、不同发酵方式对原料所产生的影响不完全相同[8]。靳双星等[9]采用混合菌种固态发酵加减四君子汤，探讨发酵对方剂中营养成分含量变化及多糖提取率的影响，结果表明，与发酵前相比，四君子汤中粗蛋白、粗脂肪含量以及多糖得率均显著提高。目前，还未有采用液体发酵方法对四君子汤营养成分的研究。乳酸菌具有无毒、独特的生理功效等特点[10]，常被用来发酵中药，因此，利用乳酸菌发酵复方中药在畜牧业养殖中具有广阔的应用前景。本文主要研究不同发酵因素对四君子汤发酵后总黄酮和总多糖含量的影响，筛选四君子汤最佳的发酵工艺，采用高效液相色谱法检测四君子汤发酵前后核苷和黄酮类成分含量变化趋势，为后期四君子汤发酵前后各类化学成分的鉴定提供参考。1材料与方法1.1试验仪器设备与材料UV-3660紫外-可见分光光度仪购自北京普源精电科技有限公司，L-3000高效液相色谱系统购自北京普源精电科技有限公司，YXQ-LS-75SII立式高压蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司疗设备厂，TDY-Z-WS湘立离心机购自湖南湘立科学仪器有限公司，AR223CN电子分析天平购自常州奥豪斯仪器有限公司，SW-CJ-2F标准型双人双面垂直工作台购自苏州净化有限公司，HH-4数显恒温水浴锅购自国华电器有限公司，200V-AC万用电炉购自北京科伟永兴仪器有限公司，C21-RT2131电磁炉购自广东美的生活电器制造有限公司，BCD-178TMPD海尔冰箱购自青岛海尔股份有限公司。四君子汤中药饮片（党参9 g、炒白术9 g、茯苓9 g、炙甘草6 g）均购自安徽灏融中药饮片有限公司；浓硫酸、甲醇、盐酸、磷酸（分析纯）均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、苯酚均购自天津市光复科技有限公司；乳酸菌菌株购自中科院微生物研究所菌种保藏中心（活菌数3.4×109 CFU/g，保藏号：BMZ133552）；芦丁对照品、D-无水葡萄糖对照品均购自北京索莱宝科技有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1菌种培养1.2.1.1液体培养基的制备牛肉膏、蛋白胨、氯化钠按质量比3∶10∶5放入烧杯中，加入适量蒸馏水，加热，搅拌至完全溶解，待溶液沸腾，停止加热，冷却至室温；在无菌超净台分装至灭菌的锥形瓶内，塞紧棉塞，裹紧报纸，于高压蒸汽灭菌锅内灭菌20 min，冷却至室温，4 ℃冰箱冷藏。1.2.1.2乳酸菌活化取出前期实验室培养的乳酸菌，置于无菌超净台上，加无菌水至试管的2/3处，振荡6 s，使用移液枪将4 mL的菌液移至40 mL液体培养基中，摇匀，在33.5 ℃、150 r/min恒温摇床中培养24 h。1.2.2四君子汤发酵1.2.2.1四君子汤水煎液制备称取两份四君子汤中草药饮片，按料液比1∶40 g/mL加入蒸馏水浸泡30 min，煎煮20~30 min，过滤。按照料液比1∶20 g/mL将滤渣煎煮30 min，趁热过滤，合并两次滤液，按照2∶1比例浓缩，即为四君子汤水煎液，冷却至室温，置于4 ℃冰箱保存。1.2.2.2四君子汤发酵液的制备量取上述四君子汤水煎液20 mL于锥形瓶中，塞紧棉塞，裹紧报纸，于高压蒸汽灭菌锅中灭菌20 min，冷却至室温，按一定比例在无菌操作台上接入乳酸菌，在特定发酵温度条件下，放入恒温摇床以特定的转速发酵一定时间可得四君子汤发酵液。1.2.3单因素试验1.2.3.1接菌量对总黄酮含量的影响按1.2.2.2进行操作，设定发酵温度32 ℃、发酵时间24 h、摇床转速180 r/min，考察不同接菌量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）对四君子汤中总黄酮含量的影响。1.2.3.2发酵温度对总黄酮含量的影响按1.2.2.2进行操作，设定试验接菌量3%、发酵时间24 h、摇床转速180 r/min，考察不同发酵温度（28、30、32、34、36 ℃）对四君子汤中总黄酮含量的影响。1.2.3.3发酵时间对总黄酮含量的影响按1.2.2.2进行操作，设定试验接菌量3%、发酵温度32 ℃、摇床转速180 r/min，考察不同发酵时间（6、12、18、24、30 h）对四君子汤中总黄酮含量的影响。1.2.3.4摇床转速对总黄酮含量的影响按1.2.2.2进行操作，设定试验接菌量3%、发酵温度32 ℃、发酵时间24 h，考察摇床转速（90、120、150、18、210 r/min）对四君子汤中总黄酮含量的影响。1.2.4响应试验设计根据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验设计，以四君子汤发酵液总黄酮含量为响应面值，以接菌量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为因素设计响应面优化试验。响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.T001表1响应面因素水平设计水平A/%B/℃C/h-12.5301803.0322413.534301.2.5紫外分光光度法测定四君子汤发酵前后成分含量1.2.5.1总黄酮含量（1）对照品溶液制备。精密称取芦丁对照品6.00 mg于25 mL容量瓶中，加入65%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，得浓度为0.24 g/L的芦丁对照品溶液。（2）供试品溶液制备。将水煎液及发酵液在高压灭菌锅内灭菌20 min，使菌灭活，冷却至室温，4 000 r/min离心10 min，弃沉淀，上清液即为供试品溶液。（3）标准曲线的绘制。精密量取0.24 g/L芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，放置3 min，加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，静置3 min，加入4%氢氧化钠溶液4 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，静置5 min，于510 nm的最大吸收波长下测定吸光度。（4）样品中总黄酮含量。精密移取4 mL供试品溶液，按照（3）操作可得样品的吸光度，根据芦丁标准曲线线性方程，计算样品中总黄酮浓度。1.2.5.2总多糖含量（1）对照品溶液的制备。精密称取D-无水葡萄糖标准品15.00 mg至10 mL容量瓶中，使用蒸馏水溶解，稀释至刻度，从中移取2 mL于10 mL容量瓶中，使用蒸馏水定容，得0.30 g/L的D-无水葡萄糖标准品溶液。（2）供试品溶液的制备。分别量取水煎液及发酵液50 mL，加无水乙醇116 mL，静置过夜，于4 000 r/min离心20 min，弃上清，沉淀加热水溶解，冷却至室温，于50 mL容量瓶定容，摇匀，得供试品溶液。（3）标准曲线的绘制。精密量取0.30 g/L的D-无水葡萄糖对照品溶液0、0.05、0.08、0.11、0.14、0.17、0.20 mL于10 mL容量瓶中，加蒸馏水至1 mL，摇匀，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，加入浓硫酸5 mL，摇匀，静置5 min，置沸水浴加热15 min，置于冷水浴冷却，在490 nm的最大吸收波长下测定吸光度。（4）样品中总多糖含量。取1 mL供试品溶液，按照（3）操作，得到样品的吸光度，根据D-无水葡萄糖标准曲线的线性方程，计算样品中多糖浓度。1.2.6高效液相色谱法测定四君子汤发酵前后成分含量1.2.6.1核苷含量（1）供试品溶液的制备。将四君子汤水煎液和发酵液20 mL抽滤，0.22 μm微孔滤膜过滤，即可得样液。（2）高效液相色谱条件。按照刘知非等[11]色谱条件进行测定。1.2.6.2黄酮含量（1）供试品溶液制备。分别精密量取水煎液及发酵液5 mL，加入10 mL水解液（甲醇∶纯水∶盐酸=7∶2∶1），超声溶解，置于68 ℃水浴锅中，3 h取出，冷却至室温，0.22 μm微膜过滤。（2）高效液相色谱条件。按照刘江亭等[12]色谱条件进行测定。2结果与分析2.1标准曲线绘制结果以不同对照品浓度（mg/L）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线绘制结果见图1。图1标准曲线绘制结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F1a1（a）芦丁标准曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F1a2（b）D-无水葡萄糖标准曲线由图1（a）可知，不同浓度的芦丁与其吸光度之间的关系呈正相关，且回归方程为Y=0.009 5X+0.020 3，相关系数R2=0.999 6，表明芦丁在12.00~60.00 mg/L间具有较好的线性关系，可以根据标准曲线换算样品中总黄酮浓度。由图1（b）可知，吸光度随葡萄糖浓度的升高而增大，拟合线性回归方程为Y=0.065 3X+0.067 9，相关系数R2=0.999 2，表明D-无水葡萄糖在2.10~8.60 mg/L内呈良好的线性关系，可以根据标准曲线换算样品中总多糖的浓度。2.2单因素试验结果2.2.1接菌量对四君子汤中总黄酮含量的影响（见图2）乳酸菌是一种可以改善胃肠道微生态平衡的益生菌，在食品中常直接作为添加剂而发挥其改善和维持肠道菌群平衡的作用[13-14]。由图2可知，乳酸菌的接种量在1.5%~3.5%范围内时，随着乳酸菌接菌量的增加，四君子汤发酵液中总黄酮含量呈先上升后下降的趋势。当接菌量为3%时，发酵液中总黄酮含量最高。当接菌量大于3%时，由于四君子汤中营养物质的减少造成乳酸菌的生长受到限制，从而转化后总黄酮含量减少。因此，选取四君子汤发酵的接菌量为3%进入后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F002图2接菌量对四君子汤中总黄酮含量的影响2.2.2发酵温度对四君子汤中总黄酮含量的影响（见图3）不同菌种的最适生长温度不同，乳酸菌的最适生长温度为37 ℃左右，且20 ℃以下不生长。不同菌种的生长温度由于用途不同也会发生相应的变化。由图3可知，发酵温度在28~36 ℃范围内时，随着发酵温度升高，四君子汤发酵液中总黄酮含量为先升高后降低趋势。当发酵温度为32 ℃时，发酵液中总黄酮含量最高，表明32 ℃适宜乳酸菌的生存并发挥调节作用，在此温度后由于温度较高导致乳酸菌存活率较低造成总黄酮含量减少。因此，确定四君子汤发酵的最佳温度为32 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F003图3发酵温度对四君子汤中总黄酮含量的影响2.2.3发酵时间对四君子汤中总黄酮含量的影响（见图4）发酵时间对于产品的口感、成分含量以及菌种多样化具有很大影响。由图4可知，发酵时间在6~30 h范围内随着发酵时间的增加，四君子汤发酵液中总黄酮含量缓慢上升后迅速下降。当发酵时间为24 h时，发酵液中总黄酮含量最高。当发酵时间延长后，可能由于乳酸菌发酵过程中产生大量酸，造成其他耐酸杂菌大量滋生对有效成分的转化造成阻碍。因此，确定四君子汤发酵的最佳时间为24 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F004图4发酵时间对四君子汤中总黄酮含量的影响2.2.4摇床转速对四君子汤中总黄酮含量的影响（见图5）适宜的摇床转速有利于菌种与培养液的全方位接触，从而促进有效成分的转化。转速过低或过高均会造成菌种分布集中，导致菌种活性降低。由图5可知，摇床转速设定在90~210 r/min范围内，随着转速提高，四君子汤发酵液中总黄酮含量先上升后下降。当转速为120 r/min，发酵液中总黄酮含量最高。因此，确定四君子汤发酵的最佳摇床转速为120 r/min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F005图5摇床转速对四君子汤中总黄酮含量的影响2.3响应面试验结果2.3.1响应面试验及方差分析结果（见表2、表3）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.T002表2响应面试验结果试验号A/%B/℃C/h总黄酮含量/（mg/L）13.03430136.0023.03224164.5332.53424136.3542.53024138.6853.53230145.8063.03224167.4573.53218146.6483.53024145.9493.03224160.70103.03030147.00113.03224163.78123.03224163.00132.53218137.73143.53424139.70153.03418139.74163.03018142.65172.53230140.89以总黄酮含量为目标产物可得到影响总黄酮含量变量之间的线性关系为：Y=163.89+3.05A-2.81B+0.37C-0.98AB-1.00AC-2.02BC-11.15A2-12.57B2-9.97C2。各因素对四君子汤中总黄酮含量的影响排序为：ABC。由表3可知，该模型项P=0.000 10.01，表明该模型极显著；失拟项P=0.832 0，表明影响不显著，因此使用上述线性方程预测四君子汤的最佳发酵条件可行度较高。决定系数R2=0.985 3，表明总黄酮含量的真实值与估算值具有很好的拟合度，可以反映各因素间的关系。在试验选取的3个因素水平范围内，A、B对总黄酮含量的影响比C明显（P0.01），二次项B2、A2、C2均对总黄酮含量的影响极显著（P0.01），表明总黄酮含量与各考察因素之间密切相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.T003表3响应面方差分析结果项目方差自由度均方F值P值显著性模型1 957.829217.5452.000.000 1**A74.60174.6017.830.003 9**B63.17163.1715.100.006 0**C1.0711.070.260.628 1AB3.8213.820.910.371 0AC4.0014.000.960.360 7BC16.36116.363.910.088 5A2523.791523.79125.220.000 1**B2665.391665.39159.070.000 1**C2418.821418.82100.120.000 1**残差29.2874.18失拟项5.2231.740.290.832 0误差24.0646.02总和1 987.1116注：R2=0.985 3，R2adj=0.966 3。2.3.2响应曲面交互作用分析（见图6）由图6可知，各响应面的最优条件均在试验水平范围内，影响四君子汤中总黄酮含量的最佳发酵条件均在此水平范围内。曲面坡度越陡峭，表明对总黄酮含量的影响越大，3D响应曲面图中BC倾斜度最大，其次为AC、AB，因此，BC交互作用对总黄酮含量的影响最大，与表4所得结论一致。图6不同因素之间交互作用对四君子汤中总黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F6a1（a）接菌量与发酵温度对总黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F6a2（b）接菌量与发酵时间对总黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F6a3（c）发酵温度与发酵时间对总黄酮含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.T004表4紫外分光光度法含量测定结果项目四君子汤/(mg/L)四君子汤发酵液/(mg/L)增加率/%总黄酮含量118.42±0.25163.89±0.2438.40±0.09总多糖含量130.63±0.11145.08±0.1011.06±0.022.3.3验证试验结果运用Design Expert 8.0软件优化预测，得到四君子汤的最佳发酵工艺为接菌量3.38%、温度31.72 ℃、时间23.97 h，在此条件下四君子汤的总黄酮含量预测值为160.059 mg/L。根据实际试验的可操作性，选择将四君子汤的发酵工艺参数改为接菌量3%、温度32 ℃、时间24 h。经3次平行试验验证得四君子汤发酵液中的总黄酮含量实际值为163.892 mg/L。此结果与模型预测值比较接近，表明回归方程与实际情况拟合度很好，可以很好地体现发酵对总黄酮含量实际变化规律。2.4四君子汤发酵前后总黄酮、总多糖及核苷含量变化2.4.1紫外分光光度法含量测定结果（见表4）由表4可知，四君子汤发酵前后总黄酮含量及总多糖含量变化较大，发酵后总黄酮含量增加率为38.4%，总多糖含量增加率为11.06%，表明乳酸菌发酵四君子汤可以在一定程度上提高有效成分的含量。2.4.2高效液相色谱法含量测定结果（见图7）由图7可知，样品发酵前后保留时间为3.727、4.140、4.890、5.720以及8.300 min左右出峰的核苷化学成分峰面积变化明显，表明乳酸菌发酵四君子汤后核苷含量变化较大。由图7（c）和图7（d）可知，样品发酵前后保留时间为2.540、2.827、3.917 min等左右出峰的黄酮类化学成分峰面积变化均不明显，但是在9.747 min以及10.700 min左右出峰的黄酮类成分峰面积变化明显。因此，乳酸菌发酵四君子汤后其中的个别黄酮类成分含量有效升高。图7四君子汤发酵前后不同成分含量变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F7a1（a）四君子汤发酵前核苷含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F7a2（b）四君子汤发酵后核苷含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F7a3（c）四君子汤发酵前黄酮含量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.017.F7a4（d）四君子汤发酵后黄酮含量3讨论本试验中，四君子汤进行液态发酵的最佳工艺为接菌量3%、发酵温度32 ℃、发酵时间24 h、恒温摇床转速120 r/min，表明经乳酸菌发酵后四君子汤中总黄酮增加38.40%、总多糖增加11.06%。通过高效液相色谱法测定后，得出四君子汤发酵后核苷类以及黄酮类成分含量均有增加趋势。但是与总黄酮和总多糖含量变化趋势不同，可能是由于样品在进行高效液相色谱条件洗脱时，流动相比例选择不恰当导致。四君子汤经乳酸菌发酵后总黄酮含量及总多糖含量增加的原因可能是乳酸菌在发酵过程中产生的果胶酶有利于黄酮类成分溶出[15]；另一方面乳酸菌可能产生β-葡萄糖酶或β-葡萄糖醛酸酶，这两种产物可使糖苷转化为苷元并进一步水解，从而提高四君子汤中的多糖成分[16]。根据本试验的结论尚未知晓具体化学成分之间转化的关联，因此还需进行后续化学成分的深入探究。4结论本试验中，四君子汤进行液态发酵的最佳工艺为接菌量3%、发酵温度32 ℃、发酵时间24 h、恒温摇床转速120 r/min，经乳酸菌发酵后四君子汤中总黄酮增加38.40%、总多糖增加11.06%。