屎肠球菌（Enterococcus faecium）是兼性厌氧的革兰氏阳性球菌，具有耐热、耐胃酸、耐胆盐、黏附力强、抑菌性和抗生素耐受性等优良饲用生物学特性[1]，可在动物肠道黏附定植，分泌产生有机酸、维生素、抗生素等代谢物，优化肠道功能，增强机体免疫力，从而改善生产性能[2-3]。屎肠球菌制剂具有安全无毒、药物残留低，可替代抗生素，已广泛应用于畜禽行业。但在贮存过程中存在活菌下降迅速等问题，导致屎肠球菌制剂的有效活菌含量低，无法达到预期效果[4]。在高浓度菌液进行固化处理的过程中，适合的保护剂可为细胞提供低温保护，抑制胞内冰晶形成，易于干燥，提供良好的基质使细胞稳定，极大程度地降低冻干过程中对菌体损伤[5-6]。因此，冻干保护剂会影响菌粉在冻干过程中的菌体存活率，影响菌体贮藏期间的稳定性[7-8]。本研究以从健康仔猪中筛选一株能够高产γ-氨基丁酸的屎肠球菌QW256[9]，通过确定菌体离心条件、采用响应面法对冻干燥保护剂配方优化，研究菌粉贮藏的稳定性，为得到高存活率、高稳定的屎肠球菌QW256冻干菌粉提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株屎肠球菌QW256为本课题组前期分离自健康仔猪肠道内容物，保藏于江西省环境微生物与生物技术重点实验室，保藏编号为JXEMB10027。1.1.2试剂及仪器主要试剂：硫代硫酸钠、氨基酸、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、蔗糖购自北京索莱宝科技有限公司；脱脂乳粉、乳清粉购自恒天然商贸（上海）有限公司；海藻糖、谷氨酸钠、抗坏血酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MRS培养基购自北京陆桥技术股份有限公司。主要仪器：FDU-1 200 EYELA真空冷冻干燥机（北京五洲东方科技发展有限公司）、TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、BLBIO-3GJ-4-H自动发酵罐（上海百伦生物科技有限公司）、BPH-9272精密恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、JJ500ZN电子天平（捷久计量衡器上海有限公司）。1.2试验方法1.2.1屎肠球菌QW256冻干菌粉制备工艺采用二级发酵制备屎肠球菌QW256菌粉，具体流程为：甘油管→菌种活化→制备种子液→发酵罐培养→离心收集菌体→制备菌悬液→添加保护剂→真空冷冻干燥→菌粉贮藏。1.2.2屎肠球菌QW256的培养与浓缩离心条件的确定将屎肠球菌QW256接种至MRS液体培养基中，摇床150 r/min、37 ℃培养12 h，以3%接种量接种于装液量为70%发酵罐，初始pH值7.0，转速100 r/min、通气量0.2 vvm，自动流加12.5%的氨水控制pH值恒定在6.5，37 ℃恒温发酵15 h获得发酵液。取菌液30 mL装于灭菌的离心管，4 ℃以离心力4 000、5 000、6 000、7 000 g均分别离心10、20 min，检测不同离心参数下的菌体存活数，分析不同条件下的离心损失率、离心存活率，进而选择最佳的离心条件。菌泥质量=离心前称取管体总质量(g)－离心去上清液后管体总质量(g)(1)离心损失率=上清液活菌总数/发酵液活菌总数×100%(2)离心存活率=菌泥活菌总数/(发酵液活菌总数-上清液活菌总数)×100%(3)离心收集率=菌泥活菌总数/发酵液活菌总数×100%(4)1.2.3悬浮基质对冷冻干燥保护效果的影响分别以新鲜培养基、1.9%硫代硫酸钠、0.9%灭菌生理盐水作为悬浮基质，按比例添加至菌泥中制备悬浮液，-20 ℃冰柜预冻12 h，放入冷阱温度为-35 ℃的真空冷冻干燥机内冷冻干燥24 h，制备冻干粉。取出冻干菌粉通过平板计数法进行准确计数，计算冻干存活率。1.2.4冻干保护剂的筛选选取复合类（脱脂乳粉、乳清粉、酵母浸粉等）、多元醇类（丙三醇、甘露醇、山梨醇等）、糖类（蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等）、氨基酸类（谷氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸等）、抗氧化剂类（谷氨酸钠、抗坏血酸钠、抗坏血酸、L-半胱氨酸盐酸盐等）作为单一冻干保护剂，研究其在冻干过程中对屎肠球菌QW256的保护效果。在悬浮液中添加不同保护剂，混匀，冷冻干燥，测定冻干后菌体存活率。1.2.5响应面法优化复合冻干保护剂从各类单体保护剂中选出冻干存活率较高的冻干保护剂，采用Box-Behnken法设计4因素3水平试验，以乳酸菌冻干存活率为响应值，优化保护剂中的关键成分，获得复合冻干保护剂的最优配方。响应面因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.T001表1响应面因素水平设计水平X1甘露醇X2蔗糖X3甘氨酸X4抗坏血酸钠-1203031.20253541.51304051.8g/L1.2.6冻干菌粉贮存稳定性每包称取5 g制备好的菌粉，充氮气，密封包装，分别置于4、25、37 ℃条件下贮藏，于贮藏的第5、10、20、40、60、80和100 d取样，使用0.9%生理盐水复溶测定其残余活菌数，与贮藏前的活菌数比较，研究贮藏时间和温度对菌粉存活率的影响。1.3数据统计与分析采用Design-Expert 8.0.6软件进行RSM试验设计、数据分析及模型建立，SPSS 26软件进行数据统计，结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1不同离心条件对菌株QW256损失率、存活率和收集率的影响（见图1、见表2）在7 L发酵罐中，按接种量3%、通气量0.2 vvm、起始pH值7.0条件下，以12.5%氨水作为中和剂，维持pH值为6.5，37 ℃培养15 h后，发酵液活菌数达3.12×1010 CFU/mL。由图1可知，接入菌种0~2 h为迟滞期，3~16 h为对数生长期，14~16 h为对数末期，16~20 h为稳定期。因此，综合考虑菌龄和菌体量，选取在对数末期的第15 h进行菌体收集。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F001图1屎肠球菌QW256的生长曲线由表2可知，离心力和时间对菌体收集率具有显著影响，随着离心力和离心时间延长，离心收集存活率先增大再减小；在相同离心力下，离心时间增加可减少菌体随上清液的流失，降低离心损失率，但6 000、7 000 g的离心收集率也随之下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.T002表2不同离心条件对菌株QW256损失率、存活率和收集率的影响项目4 000 g5 000 g6 000 g7 000 g10 min20 min10 min20 min10 min20 min10 min20 min菌泥质量/g1.35±0.121.46±0.131.51±0.141.59±0.131.63±0.141.59±0.131.57±0.121.52±0.13离心损失率/%0.51±0.030.38±0.020.40±0.030.25±0.010.22±0.010.20±0.010.21±0.010.18±0.02离心存活率/%48.20±1.9261.46±2.6567.37±2.5289.76±3.2597.79±1.8193.05±3.7594.18±3.8788.94±4.23离心收集率/%47.96±1.3561.22±2.4567.09±2.6389.54±3.1297.57±1.5992.87±4.1793.98±4.1288.78±3.86因此，从经济角度考虑应选择6 000 g离心10 min为本试验最佳离心条件，此时菌体存活率为97.79%，每30 mL发酵液获菌泥的平均质量为1.63 g。2.2不同悬浮基质对屎肠球菌QW256冻干存活率的影响（见图2）将菌泥与悬浮基质均匀混合，方便有效除去冻干材料中的多余溶剂，可在冻干过程中对微生物起一定的保护作用，并为后续微生物生长提供营养。由图2可知，适当添加盐可改善抗冻能力，减少因渗透压发生改变而对细胞产生损伤，以硫代硫酸钠溶液作为悬浮基质的菌体存活率明显高于其他为悬浮基质。因此，选用硫代硫酸钠为悬浮基质进行单一冻干保护剂筛选试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F002图2不同悬浮基质对屎肠球菌QW256冻干存活率的影响2.3单一冻干保护剂对菌株存活率的影响（见表3）由表3可知，屎肠球菌QW256的存活率在加入保护剂后均有不同程度的提高，保护剂均对其具有一定的保护作用，其中以综合类冻干保护剂保护能力整体较高；多元醇类冻干保护剂中以甘露醇的效果较好；糖类冻干保护剂中以蔗糖的效果较好；氨基酸类冻干保护剂中以甘氨酸的效果较好；抗氧化剂类冻干保护剂中以抗坏血酸钠的效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.T003表3单一冻干保护剂对菌株存活率的影响综合类存活率多元醇类存活率糖类存活率氨基酸类存活率抗氧化剂类存活率脱脂乳76.58±3.93丙三醇78.12±3.26蔗糖82.62±3.43谷氨酸67.58±2.87谷氨酸钠75.35±4.15乳清粉72.63±2.37甘露醇83.59±3.89海藻糖77.52±3.32精氨酸53.74±2.65抗坏血酸钠80.36±3.64葡聚糖78.59±3.65山梨醇77.46±3.34乳糖75.22±3.29甘氨酸79.86±3.57抗坏血酸74.23±3.16明胶75.82±3.15吐温-8069.42±3.57麦芽糖54.69±2.94脯氨酸71.61±3.24L-半胱氨酸盐65.23±3.24PEG400056.71±3.42葡萄糖68.75±3.62%甘露醇、蔗糖、甘氨酸、抗坏血酸钠对屎肠球菌QW256的保护效果相对较佳，菌株存活率分别约为83.59%、82.62%、79.86%、80.36%。2.4复合冻干保护剂的响应面优化结果（见表4、表5及图3~图8）以甘露醇、蔗糖、甘氨酸和抗坏血酸钠4个重要因素为自变量，分别标记为X1、X2、X3、X4，以冻干菌体后菌体存活率为响应值（Y）。根据表4试验结果进行响应面的回归分析，建立该模型多元二次回归拟合方程为：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.T004表4响应面试验结果试验号X1X2X3X4存活率（Y）/%1001-194.27200-1-195.093-110090.884001196.735010193.456000097.357000097.048100-192.629-1-10092.1110-100192.7311-100-193.0312110091.8713000097.15140-1-1093.8615000097.4516-101092.11170-10193.86181-10092.31190-10-194.27200-11093.7521101093.8222011093.342310-1092.7324000096.8425010-192.4226-10-1092.012701-1092.2128100193.752900-1194.8830000097.25Y=9.858+0.018X1-0.026X2+0.014X3+0.016X4+0.010X1X2+0.013X1X3+0.019X1X4+0.016X2X3+0.019X2X4+0.034X3X4-0.159X12-0.131X22-0.064X32-0.049X42。由表5可知，此模型F值为59.952，P0.000 1，表明该模型自变量与因变量之间的线性关系极显著。失拟项F值为3.577，P=0.086 10.05，失拟项不显著，表明该模型不需要添加更多的因素，模型拟合程度较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.T005表5菌株QW256响应面回归模型的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型0.289 6140.020 759.9520.000 1X10.004 110.003 911.7590.003 7X20.008 110.007 523.4130.000 2X30.002 310.002 16.7910.019 9X40.003 010.002 78.7540.009 8X1X20.000 410.000 41.2270.285 3X1X30.000 710.000 61.9070.187 5X1X40.001 410.001 14.0290.033 1X2X30.001 010.000 92.9680.105 4X2X40.001 410.001 24.0240.043 2X3X40.004 710.003 913.5570.002 2X120.174 310.152 6505.1580.000 1X220.118 110.118 1342.2990.000 1X320.027 710.027 780.2640.000 1X420.016 210.016 247.0190.000 1残差0.005 2150.000 3失拟检验0.004 5100.000 53.5770.086 1纯误差0.000 650.000 1总和0.294 729注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。此外，此模型的决定系数R2=0.982 4，修正决定系数R2adj=0.966 1，方差相差很小，表明此模型可解释96.6%的试验数据变化，预测值与实际值之间具有高度相关性。变异系数CV为0.192％，信噪比为9.697，模型的离回归偏差较小，表明方程拟合度较好。因此，可应用此模型分析和预测乳屎肠球菌QW256冷冻干燥保护剂配方。由表5可知，X1、X2、X4、X3X4、X12、X22、X32、X42对菌体存活率影响极显著（P0.01)，X1X4、X2X4具有显著的交互作用（P0.05)。由图3~图8可知，各因素相互作用的响应面均为凸形曲面，在所选范围内存在极值点，且等高线均趋近于椭圆形或马鞍形，因素间交互作用明显，与方差分析结果一致。表明甘露醇、蔗糖、甘氨酸和抗坏血酸钠均是屎肠球菌QW256冷冻干燥保护剂中的重要因素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F003图3蔗糖和甘露醇交互作用对菌体存活率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F004图4甘露醇和甘氨酸交互作用对菌体存活率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F005图5甘露醇和抗坏血酸交互作用对菌体存活率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F006图6蔗糖和甘氨酸交互作用对菌体存活率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F007图7蔗糖和抗坏血酸交互作用对菌体存活率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F008图8抗坏血酸和甘氨酸交互作用对菌体存活率的影响根据响应面建立的二次多项回归方程模型分析，以存活率最高为条件进行优化，得到最优解：甘露醇25.38 g/L、蔗糖34.65 g/L、甘氨酸4.17 g/L和抗坏血酸钠1.57 g/L，此条件下预测的菌体存活率为97.26%。采用优化得到的结果进行3次冻干验证试验，得到存活率为97.58%，与预测值吻合，表明建立的数学模型准确可靠，可信度较高，具有实际操作性，可应用于进行保护剂配方的筛选和优化。2.5贮藏时间和温度对屎肠球菌冻干菌粉存活率的影响（见图9）由图9可知，冻干菌粉在4、25和37 ℃贮藏下，随时间延长，屎肠球菌菌粉存活率呈下降趋势；菌粉在室温25 ℃条件下贮藏，其存活率远高于37 ℃，略低于在4 ℃。在室温25 ℃条件下贮藏100 d仍具有较高的菌粉存活率87.59%，具有较好的稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.016.F009图9贮藏时间和温度对屎肠球菌冻干菌粉存活率的影响3讨论在乳酸菌冻干粉的制备中，冷冻干燥和菌粉贮藏是乳酸菌产品开发重要环节[10]。冻干后的菌粉能够直接投放使用，其代谢活动基本停止，便于运输，并且其体积小易于存放[11-13]。通过添加保护剂可有效减轻冷冻干燥对菌体细胞造成的损伤，增强菌体细胞稳定性，提高菌体存活率和延长存储时间[14-15]。不同类型的保护剂保护机制不同，蔗糖可抑制细胞膜发生相变而保持液晶态稳定[13]；氨基酸类可在细胞膜和细胞壁间形成缓冲层[16]，抑制冰晶生成[17]；多元醇类可保护菌体胞内免受缺水损伤和维持细胞活力[18]；抗氧化剂类可以保护菌体细胞内参与代谢的酶活力[19]。本研究根据菌种进行特定筛选将不同类型的保护剂，以菌株的冻干存活率为响应值，通过响应面法进行组合优化，得到屎肠球菌QW256保护效果最佳的复合冻干保护剂配方为：甘露醇25.38 g/L、蔗糖34.65 g/L、甘氨酸4.17 g/L和抗坏血酸钠1.57 g/L，菌体冻干存活率为97.58%，比单一类型保护剂在保护效果均得到加强，复合保护剂在降低细胞流动性、抑制冰晶生成、保护胞内代谢酶活和提高玻璃态转化稳定性起重要作用。菌粉在货架期内的稳定存活对于其发挥益生作用具有重要意义。菌粉贮藏也受多种因素的影响[20-21]，如储存空间、储存环境、产品自身特性等。本研究不同温度贮藏不同时间后样品残余活菌数，发现在4、25 ℃条件下贮存60 d菌粉活菌数损失较少，仍保持90%以上的菌粉存活率，使屎肠球菌在常温下具有良好的稳定性，可在一定程度上提高乳酸菌产品的货架期。本试验结果表明，此保护剂配方的研发对屎肠球菌的冻干及贮藏具有很好的保护作用。4结论本研究确定了屎肠球菌QW256菌体收集的最佳离心条件为6 000 g、10 min，经探究选定1.9%硫代硫酸钠溶液作为悬浮基质。根据单因素保护剂筛选及响应面试验设计结果，确定了最佳保护剂配方为：甘露醇25.38 g/L、蔗糖34.65 g/L、甘氨酸4.17 g/L和抗坏血酸钠1.57 mg/g，经验证菌体存活率达96%以上。冻干菌粉在25、4 ℃储存45 d活菌数基本不变，活菌得率在95%以上，100 d后平均菌体存活率均超过85%，可在一定程度上提高乳酸菌产品的货架期。