贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）属于芽孢菌属，主要应用于植物疫病防治，抑制稻瘟病菌、腐霉菌、疫霉菌、丝核菌、核盘菌、青霉菌、链格孢菌等生长繁殖，可导致花生网斑病菌孢子畸形、破裂，菌丝体内电解质泄漏，细胞膜上麦角甾醇的合成受阻，脂质过氧化产物（丙二醛）含量显著升高，抑制菌丝体内蛋白质含量[1-3]。贝莱斯芽孢杆菌对小麦纹枯病具有一定的防治效果，还能够防治花生白绢病、苹果轮纹病、铁皮石斛茎腐病、油菜病害等植物病害[4-5]。近年来，随着替抗产品需求增加，关于贝莱斯芽孢杆菌应用于动物生产的研究较多。研究表明，贝莱斯芽孢杆菌可促进畜禽饲料的消化吸收，软化粪便，提高畜禽的生产性能及健雏率，还可抑制大肠杆菌，产生多种酶类、细菌素、脂肽类物质等[6-9]。在水产动物养殖中，贝莱斯芽孢杆菌能够抑制假交替单孢菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、乳链球菌、海豚链球菌、鮰爱德华氏菌，应用效果安全性较高[10-12]。贝莱斯芽孢杆菌还能够用于生产各类酶、微生物多糖、γ-聚谷氨酸[13-15]。因此，贝莱斯芽孢杆菌在畜禽养殖及动物生产中具有广阔的开发前景。本试验研究贝莱斯芽孢杆菌对畜禽养殖中霉菌的抑制作用，通过小鼠安全试验确定贝莱斯芽孢杆菌的安全性，为贝莱斯芽孢杆菌在畜禽养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株和标准菌株贝莱斯芽孢杆菌BLS-1、酒曲霉（自主分离）由大连三仪动物药品有限公司实验室提供。禾谷镰刀菌（保藏号：113713）、镰刀菌属（保藏号：340967）、鲜绿青霉（保藏号：337558）、三线镰刀菌（保藏号：21113001）、串珠镰刀菌（保藏号：2490）、雪腐镰刀霉菌（保藏号：337556）、黑霉（保藏号：40273）、青霉（保藏号：2515）、索氏离蠕孢（保藏号：36805）、尖孢镰孢（保藏号：37438）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC。1.1.2试验试剂土豆平板培养基（PDA）为自制。氯化钠、琼脂粉、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、硫酸锰（天津科密欧化学试剂有限公司）；大豆蛋白胨（山东淄博启迪生物制品有公司）；酵母浸粉、胰蛋白胨（北京双旋微生物培养基制品厂）、口服葡萄糖（潍坊盛泰药业有限公司）。1.1.3培养基的配制LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠 5 g，pH值（7.0±0.2），去离子水定容1 L。LB固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠 5 g、琼脂粉20 g，pH值（7.0±0.2），去离子水定容1 L。发酵培养基：大豆蛋白胨25 g、酵母浸粉5 g、口服葡萄糖30 g、胰蛋白胨10 g、磷酸氢二钾3 g、硫酸镁3 g、硫酸锰2 g、磷酸二氢钠3 g，pH值（7.0±0.2），去离子水定容1 L。PDA：取土豆200 g加适量水煮30 min，纱布过滤，加琼脂粉20 g，pH值（7.0±0.2），去离子水定容1 L。1.1.4试验仪器SW-CJ-1F医用洁净工作台（苏州市华宇净化设备有限公司）、DNP-9022电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、LS-B53U立式压力蒸汽灭菌器（上海医用核子仪器厂）、DT5-3低速自动平衡离心机（北京医用离心机有限公司）、TH2-C恒温摇床（太仓市实验设备厂）、生物安全柜（香港Healforce公司）、URIT-8021A全自动生化仪（南京贝登医疗股份有限公司）。1.1.5试验动物昆明小鼠以及SPF小鼠专用饲料均购自辽宁长生生物技术股份有限公司。1.2测定指标及方法1.2.1贝莱斯芽孢杆菌样品及霉菌指示菌的制备1.2.1.1贝莱斯芽孢杆菌的样品制备无菌环境下，在单菌落的平板中挑取贝莱斯芽孢杆菌BLS-1在划线LB平板培养基上，37 ℃恒温箱中培养24 h，显微镜镜检，4 ℃保存。另取单菌落接种于50 mL发酵培养基中，于37 ℃摇床中180 r/min培养24 h，作为种子液4 ℃保存。BLS-1菌体组：在无菌环境下取菌液按1%接种于500 mL发酵培养基中，重复3瓶，37 ℃摇床中180 r/min培养24 h，离心收获菌体，菌体使用无菌水洗涤离心，重复3遍，菌体通过冷冻干燥机冻干获菌粉，使用无菌水配制菌悬液浓度为125 g/L。上清液组：将BLS-1菌体组中上清液，使用0.45 μm滤器过滤除菌，利用冻干机直接冷冻干燥，获得冻干粉，使用无菌水配制混悬液浓度为125 g/L。发酵液（B1）：在无菌环境下取菌液按1%接种于500 mL发酵培养基中, 于37℃摇床中180 r/min培养48 h的发酵液。离心上清液（B2）：在B1基础上10 000 r/min离心5 min后取上清。上清过滤液（B3）：在B2基础上利用无菌滤器（0.45 μm）过滤后所得。1.2.1.2霉菌菌液及指示菌制备将生长良好的霉菌于生物安全柜无菌环境中，按GB/T 13092—2006方法测定总数量，稀释菌液。采取三点法接种，按设计标记等距离三点，平皿要求与火焰相距2~5 cm平行，利用接种环轻轻蘸取少量菌丝体或孢子点种于PDA平板表面，正置培养3~7 d，确保霉菌生长状态，培养过程中勿动。1.2.1.3贝莱斯芽孢杆菌发酵液对霉菌生长的抑制生物安全柜无菌环境下，吸取200 μL霉菌稀释液置于PDA平板中，利用涂布棒将菌液于平板中涂布均匀，将高压灭菌的牛津杯按照标记好的位置摆放，每个牛津杯中加入200 μL贝莱斯芽孢杆菌发酵液处理样品，平板置于25 ℃温箱中培养3 d，观察并记录结果。1.2.2贝莱斯芽孢杆菌的安全试验1.2.2.1急性经口毒性试验参照《微生物肥料生物安全通用技术准则》（NY/T 1109—2017）和《食品安全国家标准急性经口毒性试验》（GB 15193.3—2014），选择90只体重20 g左右的健康昆明小鼠随机分为3组，即对照组、BLS-1菌体组和上清液组，每组3个重复，每个重复10只小鼠，雌、雄各半。小鼠禁食6 h，以5 000 mg/kg BW剂量一次性灌胃。试验小鼠分组见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.011.T001表1试验小鼠分组组别数量/只样品处理给药方法对照组30无菌水一次性灌胃0.8 mL/只BLS-1菌体组30菌体一次性灌胃0.8 mL/只上清液组30发酵上清液（除菌）一次性灌胃0.8 mL/只灌胃后小鼠禁食2 h，之后正常饲养，连续观察14 d，观察各组小鼠生长、中毒症状和死亡情况，采用木花垫料。1.2.2.2饲养试验检测指标（1）安全试验。整个试验周期，每天观察各组小鼠的生长状态，记录小鼠的精神状态、饮食情况、粪便状况、中毒及死亡情况，剖检后检查昆明小鼠器官的形态和颜色等。（2）血清生化指标检测。试验结束后采血，3 000 r/min离心5 min，取血清检测白蛋白、总蛋白、球蛋白、白球比、钙、葡萄糖、尿素氮、无机磷、淀粉酶、胆固醇、谷丙转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶、肌酐、尿素氮/肌酐比、肌酸激酶等指标。（3）脏器指数和组织器官病理学检测。试验结束，各组小鼠分别称重，扑杀，剖检取心、肝、脾、肺、肾各个器官称重，计算脏器指数，取相应组织固定、切片和镜检观察。1.3数据统计与分析采用Microsoft Excel软件对数据进行整理，SPSS 17软件进行方差分析和Duncan's多重比较。结果以“平均值±标准差”，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1贝莱斯芽孢杆菌及其发酵液对多种霉菌的抑制作用效果（见表2、图1）由表2、图1可知，贝莱斯芽孢杆菌发酵后处理样品对黑霉、青霉、索氏离蠕孢霉、尖孢镰孢霉及酒曲霉均具有抑制作用，发酵液（B1）和上清过滤液（B3）对青霉的抑制效果显著高于离心上清液（B2）（P0.05）；B3对尖孢镰孢霉的抑制效果显著优于B1和B2（P0.05）；B3对酒曲霉的抑制显著高于B1（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.011.T002表2贝莱斯芽孢杆菌处理组抑制霉菌结果项目发酵液（B1）离心上清液（B2）上清过滤液（B3）黑霉11.50±1.2911.15±0.8512.33±2.30青霉19.48±1.02a16.00±0.91b18.25±0.29a索氏离蠕孢霉14.05±0.7014.80±1.1013.55±0.76尖孢镰孢霉15.65±0.83b15.48±0.83b17.38±0.48a酒曲霉15.97±0.76b15.13±1.31b16.98±0.73a三线镰刀菌18.00±0.50Aa13.00±0.50Bb—串珠镰刀菌11.00±0.50——禾谷镰刀菌19.00±0.50Aa13.00±0.60Bb—鲜绿青霉13.50±0.50a10.00±0.50b—镰刀菌属———雪腐镰刀菌16.00±0.50b18.50±0.50a—注：1.同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.“—”表示无抑菌效果。mm10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.011.F001图1BLS-1处理样品抑制霉菌的试验结果贝莱斯芽孢杆菌对三线镰刀菌、串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌、鲜绿青霉和雪腐镰刀菌具有不同程度抑制作用，而B3均无抑菌作用，其中B1对三线镰刀菌、禾谷镰刀菌的抑制效果极显著高于B2组（P0.01），鲜绿青霉的抑制效果显著高于B2（P0.05）；B2组对雪腐镰刀菌的抑制效果显著高于B1（P0.05），可能该菌株及其代谢产物在抑制霉菌指示菌中发挥作用。2.2贝莱斯芽孢杆菌安全试验结果2.2.1昆明小鼠器官的形态、颜色结果小鼠按常规饲养，试验组和对照组小鼠外观形态和颜色均正常，解剖后对照组及试验组小白鼠心、肝、脾、肺、肠道等脏器颜色和外观无明显差异。2.2.2贝莱斯芽孢杆菌对小鼠的脏器指数及末重的影响（见表3）由表3可知，上清液组和菌体组小鼠肝脏指数显著低于对照组（P0.05），上清液组和菌体组小鼠脾脏指数均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.011.T003表3贝莱斯芽孢杆菌对小鼠的脏器指数及末重的影响组别心脏指数肝脏指数脾脏指数肺脏指数肾脏指数末重/(g/只)对照组0.29±0.041.69±0.27Aa0.19±0.02b0.30±0.050.50±0.0832.79±3.32Aa上清液组0.29±0.031.51±0.22ABb0.23±0.07a0.35±0.060.49±0.0630.88±2.66ABbBLS-1菌体组0.31±0.051.38±0.17Bb0.21±0.03a0.30±0.020.47±0.0628.97±2.33Bc注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2.3小鼠脏器切片结果（见图2）由图2可知，试验组与对照组的小鼠肺泡壁厚度正常，无上皮细胞脱落现象，有分泌细胞，细胞核形态正常；可看到正常的肺泡及呼吸性细支气管及终末细支气管，BLS-1菌体组小鼠肺泡壁增厚，对照组小鼠肺泡壁增厚且有轻微炎症。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.011.F002图2小鼠脏器切片结果试验组小鼠肝脏小叶呈正常的多边形或不规则，肝细胞、肝血窦、肝索正常分布，无炎症灶出现，小叶间动脉、静脉、胆管分布正常，肝细胞胞质丰富，细胞器饱满发达，小鼠肝细胞清澈。对照组小鼠肝脏轻微变性。各组小鼠脾脏可见微量凋亡的小体出现，未发现白髓、红髓异常淤血及细胞浸润现象，无肉芽肿等异常病变。各组小鼠肾脏间隙正常，无扩张现象；肾小球及肾间质未发现充血、水肿、炎症细胞浸润等，管腔内未发现脱落的细胞。各组小鼠心脏均可见正常的心内膜、具有结缔组织和丰富血管的心肌膜及内含小血管、神经和脂肪细胞的心外膜，整体无坏死灶及炎症，间隙大小正常无扩张。2.2.4贝莱斯芽孢杆菌对小鼠血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，BLS-1菌体组小鼠血清胆固醇含量显著低于对照组（P0.05）；BLS-1菌体组和上清液组小鼠血清谷丙转氨转移酶活性极显著高于对照组（P0.01），BLS-1菌体组小鼠血清肌酸激酶指标显著高于对照组（P0.05），BLS-1菌体组小鼠血清葡萄糖指标显著低于上清液组（P0.05），极显著低于对照组（P0.01）；BLS-1菌体组小鼠血清总胆红素指标极显著低于对照组和上清液组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.20.011.T004表4贝莱斯芽孢杆菌对小鼠血清生化指标的影响项目对照组上清液组BLS-1菌体组胆固醇/(mmol/L)3.89±0.76a3.28±0.53ab3.09±0.66b淀粉酶/(U/L)1 112.22±178.481 113.67±448.43844.33±189.54钙/(mmol/L)58.94±3.7356.25±14.4058.15±2.57谷丙转氨酶/(U/L)23.89±12.63Bc52.89±24.61Aa40.89±11.98Ab肌酐/(μmol/L)56.00±15.1868.22±13.4657.44±17.98肌酸激酶/(U/L)515.78±214.79b758.44±359.87ab992.33±627.68a碱性磷酸酶/(U/L)250.11±69.61298.44±81.66298.44±81.66尿素氮/(mmol/L)8.87±0.328.40±1.497.92±0.82白蛋白/(g/L)32.71±2.6233.17±7.7034.7±2.22葡萄糖/(mmol/L)7.94±0.83Aa6.92±1.19ABa5.55±1.17Bb无机磷/(mmol/L)3.09±0.123.46±0.573.24±0.39总胆红素/(μmol/L)6.34±2.87Aa6.43±2.59Aa3.29±0.81Bb总蛋白/(g/L)58.94±3.7256.25±14.4058.15±2.573讨论贝莱斯芽孢杆菌广泛分布于自然界中，在动物肠道、水产品、海底生物、海边土壤、畜禽粪便、植物的根、茎叶等均可分离出贝莱斯芽孢杆菌。贝莱斯芽孢杆菌具有抗逆性、生长迅速、易分离等优良生物学特性，发酵后可产生丰富的代谢产物，具有良好的抗菌活性及抗应激能力。贝莱斯芽孢杆菌可产生抑制霉菌及降解霉菌毒素的次级代谢产物，如酶类、抗菌物质、植物激素等。因此，贝莱斯芽孢杆菌具有添加剂的潜质，其作为饲料添加剂能够改善畜禽肠道微生物菌群结构，调节机体脂代谢，增强免疫力，促进饲料消化吸收。近年来，关于贝莱斯芽孢杆菌的次级代谢产物的研究较多。通过全基因组生物信息学分析发现，在贝莱斯芽孢杆菌基因组上具有许多与抑菌化合物合成有关的次级代谢基因簇。芽孢杆菌在生长与繁殖过程中会产生许多具有抑菌活性的代谢产物，如细菌素、抗菌肽、脂肽类物质、表面活性素、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶、β-甘露聚糖酶和氨肽酶等[16]。贝莱斯芽孢杆菌通过合成次级代谢产物实现对病原菌的抑制作用，其中主要包括细菌素、抑菌蛋白、脂肽类物质和聚酮化合物等[17]。贝莱斯芽孢杆菌产生的抗菌类物质根据合成途径可以分为核糖体合成肽和非核糖体合成肽。核糖体合成肽是一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，由12~50个氨基酸残基，经过核糖体合成翻译后修饰，分为小RiPPs[18]、未经修饰的细菌素以及大分子抗菌蛋白[19]。贝莱斯芽孢杆菌产生的细菌素类物质主要有羊毛硫抗生素；大分子抗菌蛋白主要有几丁质酶、碱性蛋白酶和β-葡聚糖酶等；聚酮类化合物主要有macrolactin、bacillaene、difficidin等。聚酮类化合物是由微生物、植物等产生的一大类天然产物，这类物质对多种植物病原菌均具有拮抗活性，能够增强植物自身抵抗力[20]。非核糖体合成肽通过非核糖体肽合成酶（NRPS）合成，多发生于菌体生长停止后。通过NRPS识别特定的氨基酸，经过修饰如环化、酰基化、杂环化、甲基化和糖基化等过程，进而形成具有生物活性的分子肽[21]。非核糖体合成肽根据其结构的差异又可分为表面活性素、泛革素和伊枯草菌素等脂肽类抗生素[22]，由1个疏水脂肪烃链与由7~10个氨基酸组成的以酰胺键或内酯键连接构成的环肽，脂肪链的碳原子个数、氨基酸种类以及脂肪链与肽链连接方式的不同可形成不同的脂肽类型。伊枯草菌素家族包括伊枯草菌素A、抗霉枯草菌素和杆菌霉素[23]。徐淑琴等[24]在藏羊瘤胃液中分离到一株能够抑制金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌的菌，此菌具有良好的抗逆性且生长速度快，具有良好的体外益生特性。贝莱斯芽孢杆菌产生的酶类可促进饲料的消化及营养物质的吸收，产生的细菌素、脂肽类物质等可抑制细菌和霉菌等病原菌，减少细菌感染造成的成本损失，降低了霉菌对畜禽的损伤，提高了畜禽的抵抗力及生产效益。贝莱斯芽孢杆菌具有丰富的次级代谢产物，作为新型微生物制剂将具有突出的表现和应用潜力。4结论本试验自主分离的贝莱斯芽孢杆菌菌液对三线镰刀菌、串珠镰刀菌、禾谷镰刀菌、鲜绿青霉、雪腐镰刀菌和黑霉等10株霉菌致病菌均具有抑制作用。小鼠急性安全试验结果显示，试验组小鼠外观、症状、死亡情况、脏器指数、脏器组织切片观察、血清指标检测均与对照组无明显差异。初步认定试验所用贝莱斯芽孢杆菌具有安全性，可应用于饲料生产中，抑制霉菌滋生。