甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）又名蕗草、甜草、黑根草等。甘草多糖（GCP）是从甘草中提取的一种活性成分，复杂的化学结构使其具有诸多功能。马璐等[1]研究表明，在日粮中添加GCP能够增强肉鸡免疫功能，促进免疫器官发育。衣蕾等[2]研究发现，注射GCP可显著提高蛋鸡的血清抗氧化能力。王丽荣等[3]研究发现，GCP作为饲料添加剂能够显著提高肉仔鸡的生长性能，降低料重比，增加肉鸡的平均日增重。GCP还具有增强免疫力、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等生物活性[4-8]。目前，GCP在肉鸡饲料添加剂中的应用仍处于研究阶段，尚未实现大规模的实践应用，且由于所选用GCP的来源、浓度、给药方式、提取方法等不同，得到的结果也存在一定差异。本试验旨在研究GCP对肉鸡生长性能和免疫能力的影响，探究工业化生产的甘草多糖在肉鸡生产中的应用前景。1材料与方法1.1试验材料240只1日龄的AA肉鸡公雏购自洛阳市偃师市佃庄镇种鸡厂。GCP由洛阳蓝斯利科技有限公司提供。基础日粮购自洛阳六和饲料有限责任公司。植物血球凝聚集素购自合肥博美生物科技有限公司。免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、白细胞介素-4（IL-4）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒均购自上海钰博生物科技有限公司。TRIzol总RNA抽提试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。1.2试验设计选取240只公雏随机分为4组，每组6个重复，每个重复10只鸡。试验期42 d。对照组肉鸡饲喂玉米-豆粕型基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加300（300GCP组）、600（600GCP组）和900 mg/kg（900GCP组）的GCP。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）项目1~21日龄22~42日龄原料组成/%玉米58.3664.22豆粕31.2527.08豆油4.003.00玉米蛋白粉2.802.50石粉1.291.42磷酸氢钙1.491.04食盐0.300.30L-赖氨酸0.030.03DL-蛋氨酸0.230.16预混料0.250.25合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.6512.67粗蛋白质/%21.0019.00灰分/%6.008.00钙/%0.901.10总磷/%0.400.45蛋氨酸/%1.101.04赖氨酸/%0.520.90注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 11 500 IU、VD3 3 500 IU、VE 30 mg、VK3 3 mg、VB1 3.38 mg、VB2 9.00 mg、VB6 8.96 mg、VB12 0.025 mg、氯化胆碱800 mg、泛酸钙13 mg、烟酸45 mg、生物素0.08 mg、叶酸1.20 mg、Mn 60 mg、Fe 66.5 mg、Zn 88 mg、Cu 8.8 mg、I 0.7 mg、Se 0.288 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.3饲养管理试验在河南科技大学动物试验牧场进行。各组肉鸡试验期内所有饲养管理条件均保持一致，采用层叠式立体笼养，肉鸡自由采食饮水。育雏期间起始温度控制在34 ℃左右，从第1周起每2日下降1 ℃，至第3周温度保持25 ℃，湿度控制在65%。第1周光照24 h，从第2周起为23 h光照和1 h黑暗，定期清洁圈舍，常规免疫。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能记录每个重复肉鸡的日耗料量，在试验期每周最后1 d提前12 h禁食，空腹称量每只肉鸡的体重和每个重复剩余料重。计算每组肉鸡的平均日增重、平均日采食量及料重比。平均日增重=(末重-初重)/(肉鸡数量×试验天数)(1)平均日采食量=总采食量/(肉鸡数量×试验天数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.4.2免疫器官指数分别于试验第21、42 d，每个重复选择3只肉鸡，空腹12 h，称重，放血处死，称取免疫器官脾脏、胸腺、法氏囊的鲜重，精确至0.001 g，取出脾脏，液氮速冻，-80 ℃冰箱中保存。免疫器官指数=免疫器官重量(g)/体重(kg)(4)1.4.3趾间皮肤反应分别于试验第21、42 d，每个重复随机抽取1只肉鸡（黑色标记），按照Corrier等[9]所述方法测定肉鸡对植物血凝素的趾间皮肤PHA反应，即皮肤嗜碱性粒细胞超敏反应（DTH）。将200 μg PHA-P加入0.10 mL生理盐水注射至左侧趾蹼皮内，右侧趾蹼皮内注射0.1 mL生理盐水作为阴性对照。在注射前以及注射后的12、24和48 h使用数显游标卡尺测量注射部位厚度。使用刺激指数表示趾间皮肤PHA反应。PHA刺激指数=[(注射PHA-P后的右趾蹼厚度-右趾蹼的初始厚度)-(注射生理盐水后的左趾蹼厚度-左趾蹼的初始厚度)](5)1.4.4血清免疫指标分别于试验第21、42 d，每个重复选择体重相近的2只鸡，禁食12 h，称重，翅静脉采血，常规方法制备血清。采用相应试剂盒检测肉鸡血清IgM、IgG、IFN-γ、IL-2、IL-6的含量，操作步骤按照说明书进行。1.4.5肠道免疫指标肉鸡放血处死后取空肠，使用剪刀从空肠中点切下一段5 cm长的肠段，组织标本使用0 ℃生理盐水（154 mmol/L）冲洗，使用滤纸擦拭黏膜表面的肠道内容物，载玻片刮取黏膜（1~2 g）于灭菌的1.5 mL离心管中，样品在液氮中快速冷冻，置于-80 ℃保存。空肠黏膜样品（0.5 g/份）使用9 mL生理盐水稀释，4 ℃匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上清液放入1.5 mL离心管。采用相应试剂盒检测血清TNF-α、IL-4和sIgA含量，操作步骤按照说明书进行。1.4.6脾脏免疫相关基因表达根据从GenBank中检索的基因序列，采用Oligo 6.0软件与Primer Premier 5.0软件共同设计IL-2、IL-6和IFN-γ基因的引物序列，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参。荧光定量PCR引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T002表2荧光定量PCR引物序列项目引物序列（5'→3'）序列号产物大小/bpβ-actinF：CGGACTGTTACCAACACCCANM205518.2114R：CCTGAGTCAAGCGCCAAAAGIL-2F：GCTTATGGAGCATCTCTATCATCANM204153.2151R：ACTGCAGAGTTTGCTGGGTGIL-6F：CGAGAGAGAAGCCGCACCNM204628.2206R：TCCTCCAGCCCAACCTCTCIFN-γF：AACAACCTTCCTGATGGCGTNM205149.2106R：TGAAGAGTTCATTCGCGGCT取-80 ℃保存的样品，使用TRIzol法提取脾组织总RNA，使用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定RNA的纯度和浓度，OD260 nm/OD280 nm值均在1.8~2.0，检测后进行反转录合成cDNA，进行实时荧光定量PCR检测，反应体系为20 μL。扩增条件均为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；每个样品3个重复。采用相对定量法[10]（2－ΔΔCt）计算脾脏IL-2、IFN-γ和IL-6基因表达量。1.5数据统计与分析采用Excel 2016软件对试验数据进行初步整理，SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较检验。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1GCP对肉鸡生长性能的影响（见表3）由表3可知，1~21日龄，各试验组肉鸡的平均日采食量和平均日增重均高于对照组，其中600组肉鸡的平均日增重显著高于对照组（P0.05）。22~42日龄，各试验组肉鸡的料重比与平均日采食量均有所改善，但差异不显著（P0.05）。1~42日龄，与对照组相比，试验组肉鸡的平均日采食量、平均日增重和料重比差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T003表3GCP对肉鸡生长性能的影响项目对照组300GCP组600GCP组900GCP组P值1~21日龄1日龄体重/g38.90±0.7038.10±0.8038.40±1.1038.20±0.800.91421日龄体重/g794.86±34.71802.10±65.53814.45±43.73796.90±31.850.330平均日采食量/[g/(只·d)]52.19±1.9653.01±1.5954.32±1.1952.89±0.670.176平均日增重/[g/(只·d)]35.61±1.55b37.18±0.89ab37.79±1.29a36.62±0.79ab0.044料重比1.47±0.471.43±0.541.44±0.541.44±0.160.53422~42日龄42日龄体重/g2 728.26±125.562 786.35±96.832 839.89±93.422 721.35±119.350.275平均日采食量/[g/(只·d)]153.92±6.01150.75±5.08155.74±11.56161.73±16.830.464平均日增重/[g/(只·d)]95.42±4.5995.19±3.2698.35±2.9195.45±5.690.594料重比1.61±0.031.58±0.061.58±0.091.69±0.110.1541~42日龄平均日采食量/[g/(只·d)]103.05±3.61101.96±2.86105.03±6.1100.14±4.080.409平均日增重/[g/(只·d)]65.51±2.6565.28±2.3466.56±7.9261.97±6.260.602料重比1.57±0.021.56±0.061.58±0.111.63±0.250.840注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2GCP对肉鸡免疫器官指数的影响（见表4）由表4可知，21日龄时，300组与900组肉鸡的法氏囊指数高于对照组，600组和900组肉鸡的脾脏指数高于对照组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T004表4GCP对肉鸡免疫器官指数的影响项目对照组300GCP组600GCP组900GCP组P值21日龄胸腺指数3.09±0.332.82±0.992.72±0.582.88±0.420.776法氏囊指数2.81±0.682.91±0.752.46±0.422.92±0.520.537脾脏指数0.92±0.200.84±0.171.03±0.340.93±0.150.56442日龄胸腺指数2.16±0.652.32±0.532.60±0.622.33±0.550.639法氏囊指数2.07±0.482.29±0.861.94±0.682.09±0.220.797脾脏指数1.50±0.991.20±0.631.12±0.661.34±0.420.805g/kg42日龄时，300组与900组肉鸡的法氏囊指数高于对照组，各试验组肉鸡的胸腺指数均高于对照组，但差异不显著（P0.05）。2.3GCP对肉鸡趾间皮肤PHA刺激指数的影响（见表5）由表5可知，21日龄时，600组和900组肉鸡注射PHA-P 12 h后的刺激指数均显著高于对照组（P0.05）；各试验组肉鸡在注射24、48 h后的PHA刺激指数均高于对照组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T005表5GCP对肉鸡趾间皮肤PHA刺激指数的影响项目对照组300GCP组600GCP组900GCP组P值21日龄12 h0.039±0.012b0.046±0.008ab0.052±0.017a0.053±0.014a0.04324 h0.034±0.0090.037±0.0110.043±0.0070.042±0.0130.33348 h0.031±0.0060.031±0.0130.033±0.0140.036±0.0110.84642日龄12 h0.038±0.0060.051±0.0070.049±0.0120.045±0.0080.51724 h0.035±0.0090.046±0.0080.047±0.0060.041±0.0130.95148 h0.021±0.0040.039±0.0130.039±0.0140.035±0.0070.372mm42日龄时，各试验组肉鸡注射12、24和48 h的PHA刺激指数均高于对照组，但差异不显著（P0.05）。2.4GCP对肉鸡血清免疫指标的影响（见表6）由表6可知，21日龄时，300组与600组肉鸡血清IgM含量高于对照组，但差异不显著（P0.05）；600组肉鸡血清IL-6含量显著低于对照组（P0.05）。42日龄时，与对照组相比，各试验组肉鸡血清IgG和IgM含量均有所提高，但差异不显著（P0.05）；各试验组血清IL-6含量显著降低（P0.05）；600组肉鸡血清IL-2含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T006表6GCP对肉鸡血清免疫指标的影响项目对照组300GCP组600GCP组900GCP组P值21日龄IgG/(mg/L)49.34±28.8052.89±17.8153.60±28.9564.96±37.230.806IgM/(mg/L)754.72±417.45889.72±603.21926.11±567.94615.00±453.630.719IL-2/(ng/L)27.23±13.2534.01±18.3127.94±12.2127.23±18.420.854IL-6/(ng/L)25.70±11.43a27.16±7.63a13.60±2.42b16.92±10.39ab0.035IFN-γ/(ng/L)69.12±52.4578.10±38.2081.66±35.3777.46±29.600.95542日龄IgG/(mg/L)51.04±15.5951.21±14.6155.09±16.5358.89±10.570.757IgM/(mg/L)1 041.11±344.361 165.72±456.011 258.89±506.581 146.94±602.010.893IL-2/(ng/L)32.74±12.43b43.30±7.40ab54.90±18.77a35.13±6.38b0.022IL-6/(ng/L)38.03±4.46a26.43±10.13b29.62±6.68b19.22±10.01b0.007IFN-γ/(ng/L)86.31±22.7581.94±38.0990.18±17.08103.32±35.650.6362.5GCP对肉鸡肠道黏膜免疫的影响（见表7）由表7可知，21日龄，600组肉鸡的空肠黏膜sIgA含量显著高于对照组及300组、900组（P0.05）。42日龄时，各试验组肉鸡空肠黏膜sIgA含量均高于对照组（P0.05）。与对照组相比，添加GCP对21日龄和42日龄时肉鸡的空肠黏膜IL-4和TNF-α含量均无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T007表7GCP对肉鸡肠道黏膜免疫的影响项目对照组300GCP组600GCP组900GCP组P值21日龄sIgA/(mg/L)1 763.67±322.40b1 841.67±304.50b2 640.5±894.30a1 723.67±138.50b0.036IL-4/(ng/L)269.98±39.67260.83±24.51260.50±31.47248.74±21.700.704TNF-α/(ng/L)47.24±9.5942.27±6.6642.45±15.9739.42±11.050.90442日龄sIgA/(mg/L)1 605.99±258.911 760.83±395.771 710.5±564.151 707.83±350.330.927IL-4/(ng/L)268.86±53.44318.62±21.35265.21±23.92281.08±38.420.075TNF-α/(ng/L)45.43±8.3144.75±5.6839.18±10.2440.39±14.260.8362.6GCP对肉鸡脾脏免疫相关基因表达的影响（见表8）由表8可知，21日龄时，300组肉鸡脾脏IL-2相对表达量显著高于对照组（P0.05）。42日龄时，600组肉鸡脾脏IL-2表达量显著高于对照组（P0.05）。试验组肉鸡脾脏IFN-γ相对表达量在21日龄和42日龄均高于对照组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.008.T008表8GCP对肉鸡脾脏免疫相关基因表达的影响项目对照组300GCP组600GCP组900GCP组P值21日龄IL-21.23±0.55b2.90±0.80a1.63±1.03b1.48±0.40b0.003IL-61.22±0.591.16±0.201.58±0.791.32±0.570.608IFN-γ1.23±0.701.29±0.291.34±0.931.59±0.810.79942日龄IL-21.38±1.16b0.84±0.42 b2.42±1.42 a1.49±0.82b0.037IL-61.12±0.590.65±0.721.23±1.160.48±0.150.153IFN-γ1.07±0.431.44±1.282.01±0.712.10±0.990.0993讨论3.1GCP对肉鸡生长性能的影响植物多糖作为“替抗”的饲料添加剂，在改善家禽生产性能方面具有较大潜力。植物多糖（如枸杞、黄芪、白术和刺五加多糖）对肉鸡的生长性能、屠宰性能、免疫功能和抗氧化能力等均具有改善作用[11-14]。本试验结果表明，在肉鸡日粮中添加600 mg/kg GCP能够显著提高1~21日龄肉鸡的平均日增重，降低料重比，与张才等[15]研究结论一致。董永军等[16]研究发现，给每只肉鸡注射10 mg的GCP或在基础日粮中添加10 g/kg的GCP可以显著提高1~42日龄肉鸡的平均日增重，与本研究结果基本一致。GCP对肉鸡不同生长阶段效果的差异可能受试验动物种类、性别和年龄以及GCP提取方法、使用方法和使用剂量不同的影响。植物多糖可以通过抑制有害菌增殖，调节畜禽肠道微生物菌群落，促进肠道发育，从而提高机体的消化吸收能力，改善生长性能[17-18]。3.2GCP对肉鸡免疫器官指数和趾间皮肤PHA反应的影响家禽淋巴器官法氏囊、脾脏、胸腺的发育状态对其免疫状态具有重要影响，因此常使用法氏囊、脾脏、胸腺的发育状态评估肉鸡的免疫力[19]。本试验中，300GCP组和900GCP组肉鸡法氏囊重量比对照组均有所增加。孙波等[20]研究发现，饲料中添加黄芪多糖可提升肉鸡脾脏指数和法氏囊指数，促进免疫器官发育。冯元璋等[21]研究表明，芦荟多糖能够提升肉鸡法氏囊指数，增强新城疫疫苗免疫效果。综上所述，法氏囊指数提升表明日粮添加GCP可改善肉鸡的免疫功能。趾间皮肤PHA反应是一项由T细胞介导的迟发型超敏反应，可直观展现机体对植物血凝素的淋巴增殖反应过程，常用于评估细胞免疫[22-24]。Kamboh等[25]研究发现，日粮中添加染料木素或橙皮甙可显著提高肉鸡注射PHA-P 12 h后的趾蹼厚度。本试验中，21日龄时，注射PHA-P 12 h后，600GCP组和900GCP组肉鸡的PHA刺激指数明显高于对照组；42日龄时，试验组肉鸡注射12、24和48 h后的PHA刺激指数均高于对照组，表明GCP对迟发型超敏反应具有一定的增强作用。PHA刺激指数的升高可能是由于GCP可以刺激B细胞和T细胞增殖，进而增强由其介导的免疫反应[26-27]。本试验中，试验组肉鸡在注射24、48 h后的PHA刺激指数高于对照组。Azimi等[28]研究表明，肉鸡日粮中添加睡莲叶提取物可以显著提高注射PHA-P 12 h后的PHA刺激指数，但对注射24 h肉鸡的PHA刺激指数无显著影响，这可能与迟发型超敏反应的免疫应答机制有关。3.3GCP对肉鸡血清免疫指标和肠道免疫指标的影响植物多糖可以改善动物的免疫功能[29-30]。IgG、IgM和IgA在对病原微生物的免疫保护中起重要作用[31]。本试验中，21日龄时，除900GCP组外，其余试验组肉鸡血清IgG和IgM含量均高于对照组；42日龄时，各试验组肉鸡血清IgG和IgM含量均高于对照组。结果表明，GCP在一定程度上可促进机体免疫球蛋白产生，提高肉鸡免疫能力。朱韵辰等[32]研究表明，乌拉尔GCP能够提高肉鸡血清中IL-2和IFN-γ的水平，促进细胞活性因子分泌，从而增强机体的免疫能力。IFN-γ可以激活吞噬作用，增强NK细胞活性，从而介导细胞免疫。IL-2主要通过刺激和维持T细胞的增殖和分化，促进其他细胞因子分泌。机体发病时，IL-6水平增高，且升高水平与感染的严重程度一致。因此，IL-6作为一种炎症标志物在临床应用中愈发广泛[33]。本试验中，日粮添加GCP可显著降低肉鸡的血清IL-6含量，提高42日龄时肉鸡血清IL-2含量，但对IFN-γ含量无显著影响，表明日粮中添加GCP可有效增强肉鸡的免疫力，减少炎症发生。肠道是机体主要的消化器官，也是最大的免疫器官，动物肠道健康与其生长性能、代谢状况、免疫功能及最终的动物产品质量密切相关。肠道健康主要分为营养吸收、黏膜屏障、肠道微生物和免疫系统[34]。本试验中，添加GCP对肉鸡肠道黏膜免疫表现一定的促进作用，显著提高了21日龄时600组肉鸡空肠黏膜sIgA含量，表明日粮中添加GCP可从多方面改善肉鸡的免疫状态。GCP对肠道黏膜免疫的作用机制仍需进一步研究，GCP或可通过影响肠道菌群进而影响肠道免疫系统与肠道菌群复杂的相互作用[6,16]。3.4GCP对肉鸡脾脏免疫相关基因表达的影响脾脏是参与机体免疫应答的重要器官，含有较多的B细胞、T细胞和巨噬细胞，是连接先天性和适应性免疫的枢纽场所[35-36]。左博靖[37]研究表明，GCP可以减少小鼠调节性T细胞IL-10和TGF-β分泌。程鹏等[38]检测口蹄疫疫苗免疫后小鼠血清中的细胞因子水平，发现膜提取法提纯的GCP可以显著提高血清IL-2和IL-6含量。马璐等[1]研究发现，GCP能够显著提高21日龄肉鸡脾脏IFN-γ和IL-2的表达。本研究发现，GCP能够降低肉鸡脾脏IL-6的表达，提高脾脏IFN-γ的表达，与血清中相关因子的蛋白水平一致。原因可能是GCP中的活性成分引起信号分子和转录因子表达的变化，刺激细胞因子释放，从而增强机体免疫调节能力[39]。本试验中，21日龄的300GCP组和42日龄的600GCP组肉鸡脾脏IL-2基因表达显著升高，21日龄300GCP组肉鸡的血清IL-2含量虽高于对照组，但差异不显著。二者趋势相同但略有差异，可能受肉鸡不同生长时期免疫器官发育情况和免疫功能状态的影响，与免疫系统的负反馈调节机制有关。GCP对21日龄PHA刺激指数的提高可能是由于IL-2基因表达和血清含量的提高刺激了T细胞的生长和增殖，从而促进由T细胞介导的迟发型超敏反应过程。本试验中，900GCP组肉鸡脾脏基因表达和血清免疫球蛋白含量等数据与对照组相比均无较大变化，表明较高浓度的GCP并不能进一步提高肉鸡的免疫功能。综上所述，肉鸡日粮中添加适量GCP能够改善肉鸡的免疫状态，促进肉鸡健康生长。4结论本研究结果表明，在日粮中添加GCP对肉鸡的生长性能具有促进作用，可以提升肉鸡前期增重，改善血清和肠道免疫状态，增强趾间皮肤PHA反应，上调脾脏免疫相关细胞因子的基因表达水平，提升机体免疫力。本研究条件下，GCP的最适添加浓度为600 mg/kg。