苜蓿富含各种营养物质以及生物活性物质[1-2],是一种优质的粗饲料,在畜牧行业中广泛应用。但在潮湿多雨的地区,运输、制作、饲喂等环节均会影响苜蓿品质,导致发霉变质,营养价值严重下降,从而造成损失。而制备优良苜蓿青贮具有适口性好、消化率高、不易变质等优点[3]。与苜蓿干草相比,苜蓿青贮粗蛋白含量略高,但苜蓿干草的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量高于苜蓿青贮[4]。研究表明,使用2 kg干物质的苜蓿青贮替代苜蓿干草可以改善牛奶品质,提高养殖效益[5]。干物质采食量以及干物质消化率是限制动物生产的第一限制因素。研究表明,苜蓿青贮在瘤胃中比苜蓿干草更容易通过以及消化,干物质苜蓿青贮替代50%干物质苜蓿干草可以增加奶牛采食量[6-7]。本试验中,采用瘤胃体外发酵的方式,研究苜蓿青贮替代苜蓿干草对瘤胃体外发酵参数的影响,旨在筛选苜蓿青贮替代苜蓿干草的最佳比例组合。1材料与方法1.1试验材料试验用全株玉米青贮(WCS)、小麦秸秆(WS)、苜蓿干草(AH)、苜蓿青贮(AS)均由沧州中特牧业有限公司提供。试验前将原料放入65 ℃烘箱内烘48 h直至恒重,粉碎,过20目筛,置于干燥密封环境保存。试验原料营养成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.001.T001表1试验原料营养成分(干物质基础)项目WCSWSAHAS干物质93.3191.0094.7593.65粗蛋白质7.732.9013.4118.65粗脂肪4.041.881.352.38粗灰分3.1410.448.6016.51中性洗涤纤维37.1272.9453.3243.78酸性洗涤纤维21.4845.1842.4633.74%1.2试验设计试验采用单因子重复设计,将WCS、WS、AH、AS的比例分别设置为60∶20∶20∶0(A组)、60∶20∶16∶4(B组)、60∶20∶12∶8(C组)、60∶20∶10∶10(D组)、60∶20∶8∶12(E组)、60∶20∶4∶16(F组)、60∶20∶0∶20(G组)7个组合,每组3个重复,同时设置3个空白组用以校正。1.3体外发酵试验将0.5 g发酵底物装入编号称重的纤维袋中,密封,放入干燥环境中。将100 mL发酵瓶编号,把对应的纤维袋放入发酵瓶中。参照Menke等[8]方法配制人工缓冲瘤胃液,39 ℃条件下通入CO2直至无氧。瘤胃液取自3头体况、年龄相近,装有瘤胃瘘管的荷斯坦阉牛。将人工瘤胃缓冲液和荷斯坦阉牛的瘤胃液以3∶1混合,搅匀,每个发酵瓶装入60 mL混合瘤胃液密封,将发酵瓶置于39 ℃恒温气浴摇床中,分别在发酵开始的第2、4、8、12、24、36、48 h测定瘤胃体外产气量并使用空白组进行对照校正。1.4测定指标及方法1.4.1产气量以及产气参数根据Mauricio等[9]方法测定各时间点累积的产气量(GP)。测定各组在2、4、8、12、24、36和48 h时的产气量,计算产气参数。GP=a+b(1-e-ct)(1)式中:t为发酵时间(h);GP为t时刻的产气量(mL);a为快速降解部分产气量(mL);b为慢速降解部分产气量(mL);c为产气速率常数(%/h);a+b为潜在产气量(mL)[10]。1.4.2干物质消化率(IVDMD)在体外发酵试验进行48 h时,使用冰水覆盖发酵瓶终止发酵,取出纤维袋,使用蒸馏水冲洗干净,在105 ℃烘箱内将烘至恒重,称量发酵前后纤维袋重量。IVDMD=(发酵前底物重量-发酵后底物重量)/发酵前底物重量×100%(2)1.4.3发酵参数发酵48 h时取出发酵瓶,冰水浴终止发酵,将发酵瓶摇匀,开盖,使用UB-7pH测定仪(美国)测定发酵液pH值。分别使用10、15 mL离心管装上发酵液,参照冯宗慈等[11]方法测定15 mL离心管内发酵液体外发酵NH3-N含量;分别参照苏海涯[12]和Erwin等[13]方法测定10 mL离心管内发酵液的MCP产量和VFA含量。1.5数据统计与分析采用Excel 2016对数据进行统计整理,SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析,Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1AS替代AH对瘤胃培养液体外产气量及产气参数的影响(见表2、表3)由表2与表3可知,随着AS替代AH比例增加,各组瘤胃培养液的产气速率常数(c)差异不显著(P0.05),但各组间各相同时间点的GP呈先增加后下降的趋势。A组瘤胃培养液在各个时间点的累计产气量均最低,而D组在各个时间点的累计产气量最高,且D组瘤胃培养液的快速降解部分(a)、慢速降解部分产气量(b)和潜在产气量(a+b)均高于其他组,而A组的快速降解部分(a)、慢速降解部分产气量(b)和潜在产气量(a+b)均低于其他组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.001.T002表2AS替代AH对瘤胃培养液体外产气量的影响项目GP2 hGP4 hGP8 hGP12 hGP24 hGP36 hGP48 hA组12.04d15.13c24.55b37.22b58.12c78.75c94.99cB组14.56cd17.75c32.05a47.19a68.51ab88.61abc104.79abcC组19.08ab21.33ab34.20a48.99a73.15a93.68ab112.29abD组20.44a22.12a33.38a49.92a73.39a96.15a114.21aE组15.86bc18.50bc32.22a46.84a69.11ab89.51abc106.46abcF组15.86bc17.47c33.42a46.69a66.55ab84.11bc101.16bcG组13.85cd17.31c27.53b41.86b62.18bc79.84c95.95cSEM0.700.600.871.051.351.721.96P值0.0010.0050.0020.0010.0020.0130.022注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P0.05);下表同。mL10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.001.T003表3AS替代AH对瘤胃培养液体外产气参数的影响项目a/mLb/mLa+b/mLc/(%/h)A组5.33c132.67c146.39c0.016B组8.02bc159.77ab168.27abc0.021C组11.06ab167.67ab173.54ab0.025D组13.72a172.50a183.50a0.026E组8.50bc161.57ab169.58ab0.024F组6.68c151.91abc157.24bc0.021G组5.87c145.53bc152.21bc0.020SEM0.713.543.440.000P值0.0010.0130.0200.1432.2AS替代AH对瘤胃培养液IVDMD、发酵参数的影响(见表4)由表4可知,各组瘤胃培养液的IVDMD差异不显著(P0.05),D组瘤胃培养液的MCP、NH3-N含量均高于其他组,A组瘤胃培养液的MCP、NH3-N浓度含量均低于其他组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.001.T004表4AS替代AH对瘤胃培养液IVDMD、发酵参数的影响项目IVDMD/%NH3-N/(mg/L)MCP/(g/L)pH值A组6855.60d3.74b6.85aB组6982.20bc4.89ab6.83abC组7392.30ab5.20ab6.79cD组7497.30a5.67a6.77cE组7191.00ab4.95ab6.79bcF组6982.20bc4.70b6.84aG组6973.30c4.52ab6.85aSEM03.200.150.00P值0.4200.0010.0080.001各组瘤胃培养液间pH值介于6.77~6.85之间,D组瘤胃培养液的pH值最小,A组和G组的pH值最大。2.3AS替代AH对瘤胃培养液VFA的影响(见表5)由表5可知,F组瘤胃培养液的异丁酸含量显著高于其他组(P0.05),D组瘤胃培养液的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含量均高于其他组。A组瘤胃培养液的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸、总挥发性脂肪酸含量、戊酸含量均低于其他组。G组瘤胃培养液的乙酸/丙酸比值最小,D组最大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.001.T005表5AS替代AH对瘤胃培养液VFA的影响项目乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)总挥发性脂肪酸/(mmol/L)乙酸/丙酸A组30.25c11.22c4.73c0.91b0.49d0.37c47.98c2.70B组34.82bc11.91bc5.83bc1.03b0.61bc0.49b54.70bc2.93C组38.38b13.74ab5.84bc0.96b0.66ab0.45bc60.02b2.79D组46.05a15.58a7.26a1.31a0.70a0.51b71.41a2.96E组34.95bc12.23bc5.90b0.97b0.57c0.42bc55.05bc2.86F组33.38bc12.72bc5.65bc0.65c0.56cd0.63a53.60bc2.61G组30.94c14.00ab5.42bc1.03b0.50d0.46bc52.35bc2.25SEM1.310.370.190.040.020.021.810.07P值0.0030.0070.0050.0010.0010.0030.0020.0533讨论3.1AS替代AH对瘤胃培养液产气量及产气参数的影响发酵底物产生的气体源于发酵底物中的碳水化合物和粗蛋白,GP含量表示饲料中可发酵物质含量以及瘤胃微生物活性[14],可发酵物质含量越高,瘤胃微生物活力越强,GP含量越高,反之GP含量越低。本试验中,A组(20%AH)瘤胃培养液GP含量低于G组(20%AS),可能是因为A组的ADF与NDF的含量较高。有研究表明,发酵底物中ADF和NDF等难以发酵成分含量与GP呈负相关[15]。本试验中,各组瘤胃培养液48 h的GP含量均小于其潜在产气量(a+b),表明48 h后达到各组的产气高峰,造成此结果的原因可能是各组中所含的不易被发酵的结构性碳水化合物含量较高。饲料中的碳水化合物分为非结构性碳水化合物和结构性碳水化合物。非结构性碳水化合物(淀粉等)比较容易被发酵,发酵速度快,非结构性碳水化合物高的饲料出现产气高峰的时间大概是产气24 h后,而结构性碳水化合物(纤维等)不易被微生物快速发酵,所以与非结构性碳水化合物相比,结构性碳水化合物含量高的饲料产气高峰会推迟,一般在48 h以后[16]。D组(10%AH+10%AS)瘤胃培养液的产气量、产气速率最高,高于A组(20%AH)和G组(20%AS),表明AS替代AH可以一定程度上提高瘤胃微生物活性。原因可能是不同的饲料组合比例改变了瘤胃液的产气规律,出现了正饲料组合效应[17]。3.2AS替代AH对瘤胃培养液发酵指标的影响IVDMD越高表明动物的消化能力越强,饲料可利用性越高[18],IVDMD也可以衡量饲料的营养价值[19]。研究表明,消化率越高,GP越高[20],与本试验结果一致。瘤胃液pH值可以影响瘤胃微生物活性以及微生物区系的稳定性,是评价瘤胃发酵水平的综合指标之一[21]。瘤胃微生物正常生存发酵的pH值是6~7[22]。本试验中,各组瘤胃培养液的pH值均在6.77~6.85,适合瘤胃微生物的生长发酵。McDonald等[23]研究发现,瘤胃中的NH3-N含量为50~250 mg/L最适合瘤胃微生物生长繁殖。本试验中,NH3-N的变化范围是55.6~97.3 mg/L。瘤胃液中的含氮物质被瘤胃中的微生物转化为NH3-N,生成的NH3-N可以继续转化为MCP。而在发酵瓶中,发酵液中的含氮物质转化NH3-N继续转化为MCP后,剩下NH3-N只能继续留在发酵液中。NH3-N含量过大或者过小均会影响瘤胃微生物活性,进而影响动物的生产性能[24]。MCP可以反映瘤胃液中含氮物质被瘤胃微生物分解利用的程度,更为反刍动物小肠提供了约50%可吸收蛋白[25]。微生物转化NH3-N效率越高,MCP含量越高[26]。本试验中,D组(10%AH+10%AS)瘤胃培养液的NH3-N含量最高,表明AS替代AH提高了瘤胃微生物将含氮物质转化为NH3-N以及将NH3-N转化为MCP的效率。本试验中,A组(20%AH)瘤胃培养液NH3-N含量小于G组(20%AS),可能是G组的粗蛋白含量相对较高,随着AS占比的提升,各组NH3-N含量大致呈先升后降的趋势,与MCP趋势大致一样。碳水化合物在反刍动物瘤胃中经过瘤胃微生物发酵产生的VFA,为反刍动物的生命活动提供着其所需要的能量以及合成乳脂肪和体脂的原料[27],也帮助瘤胃微生物增殖生长[28-29]。因此,VFA在反刍动物能量代谢起重要作用。瘤胃中的VFA浓度与碳水化合物消化率呈正相关[30]。瘤胃中VFA主要由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸等组成,而发酵底物不同,产生的VFA成分不同。如果发酵底物纤维素含量高,如WS等,则产生的VFA中乙酸含量较高,如果发酵底物中的易发酵的碳水化合物含量高,如玉米等,则产生丙酸含量较高[31]。本试验中,因为WCS、AS和AH纤维含量很高,且各组的乙酸含量都高于丙酸含量,故本试验属于乙酸型发酵。本试验中,D组(10%AH+10%AS)的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸、总挥发性脂肪酸含量高于其他组,且各组之间的乙酸/丙酸值差异不显著,表明在该组合比例下,发酵底物更容易被吸收利用。4结论本试验条件下,D组(10%AH+10%AS)的瘤胃体外发酵效果最佳,所以最佳组合比例为WCS∶WS∶AH∶AS为60∶20∶10∶10。
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