鸡传染性法氏囊病（IBD）是引起家禽发生的一种高度接触性传染病，目前预防IBD的方法是执行严格的消毒措施，接种疫苗进行防控；但是很多商品化鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）疫苗可诱导机体产生较高的母源抗体，存在免疫原性差、注射部位出现肿胀溃烂、不易吸收等缺点[1-2]。刺五加多糖（ASPS）具有良好的免疫调节、抗肿瘤、抗感染、解毒等功效[3]。刺五加多糖纳米乳（ASPS-NE）是采用纳米技术制成的多糖纳米制剂，可解决多糖在体内代谢快、易分解、生物利用度低的问题，能够诱导并增强机体的特异性免疫应答，可作为一种免疫增强剂提高机体的免疫反应[4]。姬普雨等[5]研究发现，刺五加多糖能够提高肉鸡的生长性能、免疫功能和抗氧化能力，适宜的添加量为1 000 mg/kg。杨海峰等[6]研究发现，日粮添加抗生素和刺五加提取物能够明显提高断奶仔猪的平均日增重，降低料重比和腹泻率，显著提高血清中免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）水平。Fan等[7]在日粮中添加刺五加多糖可使仔猪平均日增重增加74 g/d，平均日采食量增加107.87 g/d，腹泻率显著降低21.25%。扆妍妍等[8]研究刺五加、黄芪等组成的复方“刺黄增蛋液”对蛋鸡后期生产性能的影响，按照0.25、0.50、1.00 g/L剂量加入蛋鸡饮用水中，发现蛋鸡的料蛋比分别极显著降低11.42%、8.66%、11.02%，平均蛋重显著增加，平均日产蛋量具有升高趋势。对黄芪多糖进行剂型改造，研制出的黄芪多糖纳米乳具有毒性低、安全性好的优点，可提高疫苗的免疫效果，增强机体的免疫力[9-10]。冯志华等[11]研究发现，枯草芽孢杆菌与ASPS配合对蛋雏鸡的免疫器官指数和肠道菌群均具有明显的改善作用。本试验以不同剂量的刺五加多糖纳米乳为佐剂配合鸡法氏囊灭活疫苗使用，研究其对雏鸡免疫力的影响，筛选刺五加多糖纳米乳作为免疫增强剂的最佳剂量，为刺五加多糖纳米乳在畜牧养殖中的使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物1日龄AA肉鸡购自郑州大学实验动物中心。1.1.2主要药品、试剂及仪器刺五加多糖购自陕西斯诺特生物科技有限公司（纯度98%）；刺五加多糖纳米乳按照实验室前期的方法制备[4]，稀释成浓度为32、64、128 g/L。95%乙醇、氯仿、正丁醇（天津大茂化学试剂有限公司），IL-2、IL-4、IFN-γ试剂盒（上海朗顿生物有限公司），Chicken IBDV-Ab Elisa Kit（睿信生物科技有限公司）、黄芪精（扬子江药业集团有限公司）、法氏囊灭活苗（中牧实业股份有限公司）。371型CO2培养箱、LUX型酶标仪（Thermo Fisher公司）、BX45倒置生物显微镜（OlymPus公司）、X1R型离心机（艾本德公司）、SW-CJ-1G型超净工作台（苏州净化设备有限公司）、SPX-250BS型生化培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。1.2试验设计选用1日龄AA肉鸡140只，随机分为7组，每组4个重复，每个重复5只鸡，ASPS-NE（L）组鸡注射32 g/L刺五加多糖纳米乳0.2 mL，ASPS-NE（M）组鸡注射64 g/L刺五加多糖纳米乳0.4 mL，ASPS-NE（H）组鸡注射128 g/L刺五加多糖纳米乳0.6 mL，单独法氏囊疫苗组每只鸡注射0.3 mL法氏囊疫苗，空白对照组每只鸡注射0.3 mL生理盐水，阳性对照组鸡注射10 g/L黄芪精0.4 mL，空白纳米乳组鸡注射0.4 mL纳米乳。除空白对照组外，其余组从14日龄开始首次免疫，肌肉注射上述各组药物及法氏囊疫苗，在21、28 d进行二免和三免。在第21、28、35 d每组随机选择3只鸡进行解剖采样进行后续试验。参考叶建萍等[12]采用肉鸡饲养标准配制日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。试验期35 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米54.27代谢能/(MJ/kg)12.72豆粕33.00粗蛋白质/%19.61鱼粉5.00有效磷/%0.36大豆油4.00钙/%0.81碳酸氢钙1.00赖氨酸/%0.46预混料1.00蛋氨酸+胱氨酸/%0.43石粉1.30食盐0.30赖氨酸0.04蛋氨酸0.09注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 1 500 IU、VD3 200 IU、VE 10 mg、VK 0.50 mg、VB1 1.80 mg、VB2 3.6 mg、泛酸10 mg、烟酸25 mg、VB6 3.5 mg、叶酸0.55 mg、VB12 120.0 mg、生物素0.15 mg、胆碱1 300 mg、锰60 mg、锌40 mg、铁80 mg、铜8.0 mg、碘0.35 mg、硒0.15 mg。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理鸡舍温度控制在（35±1）℃，24 h充足光照，随着雏鸡日龄的增长，饲养温度从室温度恢复至常温。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能以重复组为单位记录肉鸡的试验开始和结束时体重，统计试验期间肉鸡采食量，计算肉鸡的平均日采食量、平均日增重和料重比[12]。平均日采食量=总采食量/试验天数(1)平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.4.2IBD抗体水平分别在试验第21、28、35 d采血，室温静置，待血完全凝固，3 000 r/min离心15 min，使用IBD ELISA抗体试剂盒对血清进行IBD抗体检测[13]。试验结束后计算阴性和阳性平均值，当X¯PC-X¯NC0.075，X¯NC≤0.15时，测定结果有效。1.4.3免疫器官指数分别在试验第21、28、35 d从各组选取3只雏鸡，屠宰前雏鸡空腹称重，测定雏鸡免疫器官重量，计算各组免疫器官指数[14]。免疫器官指数=脏器重量/体重(4)1.4.4血清细胞因子参考林宏远等[15]方法测定血清细胞因子含量。在试验第21、28、35 d每组选取3只雏鸡采血，室温静置，待血液完全凝固，2 000 r/min离心10 min取上清液，使用试剂盒检测血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量。1.5数据统计与分析采用SPSS 7.0对数据进行分析，Tukey多重比较检验和单因素方差分析比较各组间差异。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1ASPS-NE对雏鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，与纯疫苗组、空白对照组、空白纳米组比，ASPS-NE（M）组、阳性对照组雏鸡的平均日增重均显著提高（P0.01），料重比极显著降低（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T002表2ASPS-NE对雏鸡生长性能的影响组别初重/g末重/g平均日增重/[g/(只·d)]平均日采食量/[g/(只·d)]料重比ASPS-NE（L）组35.13±1.281 827.48±20.1851.21±1.3298.02±1.211.91±0.21ASPS-NE（M）组36.12±1.321 995.42±32.2455.98±1.54ABC99.23±1.171.77±0.24ABCASPS-NE（H）组35.31±1.531 905.01±25.4153.42±1.18aBC100.02±1.251.89±0.18aC纯疫苗组36.23±1.651 789.03±22.1750.08±1.2599.31±1.241.94±0.16空白对照组36.46±1.231 793.81±24.7550.21±1.32101.15±1.642.04±0.23b阳性对照组35.52±1.432 012.32±37.5856.48±1.64ABC98.72±1.311.74±0.19ABC空白纳米组36.15±1.251 848.45±18.4751.78±1.24ac99.02±1.611.91±0.25c注：与纯疫苗组对比，肩标a为差异显著（P0.05），A为差异极显著（P0.01）；与空白纳米乳组相比，肩标b为差异显著（P0.05），B为差异极显著（P0.01）；与空白对照组对比，肩标c为差异显著（P0.05），C为差异极显著（P0.01）；表3~表6与此同。2.2ASPS-NE对雏鸡血清IBD抗体水平的影响（见表3）由表3可知，首免后，除空白对照组外，各组合格率为50%，ASPS-NE（L）组、ASPS-NE（M）组未出现阳性结果，可能存在免疫不合格和剂量不够的问题。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T003表3ASPS-NE对雏鸡血清IBD抗体水平的影响组别21 d28 d35 dOD值判定合格率/%OD值判定合格率/%OD值判定合格率/%ASPS-NE（L）组0.182 3-500.256 7+1000.269 3+100ASPS-NE（M）组0.184 9-0.299 9+0.356 4+ASPS-NE（H）组0.237 4+0.373 5+0.428 0+纯疫苗组0.210 4+0.263 3+0.295 8+空白对照组0.125 3-0.142 7-0.131 0-阳性对照组0.193 9+0.305 9+0.357 5+空白纳米组0.118 2+0.235 3+0.273 3+注：“+”表示合格，“-”表示不合格。第二次、三次免疫后，除空白对照组外，各组均出现阳性率100%。结果表明，刺五加多糖纳米乳作为鸡法氏囊灭活疫苗的免疫佐剂对鸡法氏囊疫苗的免疫增强效果较明显。2.3ASPS-NE对鸡免疫器官指数的影响（见表4）由表4可知，第二次、三次免疫之后，ASPS-NE（M）组、ASPS-NE（H）组雏鸡的脏器指数均有不同程度的提高，表明刺五加多糖纳米乳在合适的剂量方可发挥最佳免疫增强作用。与空白纳米组相比，第二次免疫后，ASPS-NE（M）组雏鸡的脏器指数均极显著升高（P0.01）；第三次免疫后，ASPS-NE（M）雏鸡的脾脏、法氏囊指数均极显著提高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T004表4ASPS-NE对雏鸡免疫器官指数的影响项目胸腺指数脾脏指数法氏囊指数21 dASPS-NE（L）组0.28±0.100.11±0.030.84±0.60ASPS-NE（M）组0.15±0.040.07±0.000.16±0.05ASPS-NE（H）组0.10±0.010.10±0.010.18±0.01纯疫苗组0.21±0.070.11±0.021.20±1.02空白对照组0.15±0.040.08±0.030.11±0.00阳性对照组0.40±0.210.12±0.040.13±0.03空白纳米组0.25±0.130.12±0.050.17±0.0328 dASPS-NE（L）组0.21±0.00abC0.11±0.00C0.16±0.00BCASPS-NE（M）组0.30±0.01ABC0.13±0.01ABC0.18±0.00aBCASPS-NE（H）组0.40±0.02abC0.12±0.01abC0.23±0.02ABC纯疫苗组0.19±0.010.08±0.000.11±0.02空白对照组0.04±0.010.00±0.000.02±0.00阳性对照组0.42±0.040.08±0.000.16±0.01空白纳米组0.26±0.010.08±0.000.07±0.0135 dASPS-NE（L）组0.20±0.01Ca0.11±0.00C0.16±0.00BCASPS-NE（M）组0.31±0.02AbC0.15±0.01ABC0.18±0.00aBCASPS-NE（H）组0.40±0.03AC0.12±0.01abC0.23±0.02ABC纯疫苗组0.19±0.010.09±0.000.11±0.02空白对照组0.04±0.010.01±0.000.02±0.00阳性对照组0.42±0.040.08±0.000.16±0.01空白纳米组0.26±0.010.08±0.000.07±0.012.4ASPS-NE对雏鸡血清中细胞因子表达的影响2.4.1ASPS-NE对雏鸡血清中IL-2表达量的影响（见表5）由表5可知，与空白对照组相比，三次免疫后，各ASPS-NE组雏鸡血清中IL-2表达量极显著升高（P0.01）。与空白纳米组相比，第21、35 d时ASPS-NE（M）组、ASPS-NE（H）组雏鸡血清中IL-2表达量均极显著升高（P0.01）；第28 d，ASPS-NE（H）组雏鸡血清中的IL-2表达量极显著升高（P0.01），表明纳米乳单独作为佐剂有免疫增强的效果。与纯疫苗组相比，ASPS-NE（M）组在28 d时雏鸡血清中IL-2表达量极显著升高（P0.01），21和35 d时，ASPS-NE（H）组雏鸡血清中IL-2表达量极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T005表5ASPS-NE对雏鸡血清中IL-2表达量的影响组别21 d28 d35 dASPS-NE（L）组32.89±1.79C46.15±0.47C44.82±1.89CASPS-NE（M）组49.10±2.70aBC49.18±2.78AC71.90±0.23aBCASPS-NE（H）组53.50±1.55ABC81.34±0.66BC78.48±2.98ABC纯疫苗组35.69±1.5149.41±12.0049.12±9.15空白对照组13.83±1.5614.95±4.9314.29±1.63阳性对照组38.69±1.6349.61±3.2269.35±3.19空白纳米组28.08±2.5737.78±1.9236.70±1.02ng/L2.4.2ASPS-NE对雏鸡血清中IL-4表达量的影响（见表6）由表6可知，与空白对照组相比，三次免疫之后，各ASPS-NE组IL-4的表达量均极显著升高（P0.01）。与空白纳米组相比，21和28 d时ASPS-NE（M）的IL-4的表达量显著升高（P0.05），35 d的IL-4的表达量极显著升高（P0.01）；21和35 d，ASPS-NE（H）组雏鸡血清IL-4的表达量极显著升高（P0.01）。与纯疫苗组相比，ASPS-NE（L）组在35 d时IL-4的表达量显著升高（P0.05），ASPS-NE（M）组在35 d时IL-4的表达量极显著升高（P0.01），28 d时IL-4的表达量显著升高（P0.05）；ASPS-NE（H）组在35 d时IL-4的表达量极显著升高（P0.01），21和28 d时IL-4的表达量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T006表6ASPS-NE对雏鸡血清中IL-4表达量的影响组别21 d28 d35 dASPS-NE（L）组100.89±7.43C124.59±2.60C131.41±0.10aBCASPS-NE（M）组114.55±12.83bC144.31±9.6abC153.02±1.60ABCASPS-NE（H）组130.13±1.59aBC142.49±9.49abC143.45±3.62ABC纯疫苗组72.26±3.5485.61±14.79116.92±2.44空白对照组11.68±9.7833.49±8.9071.31±1.95阳性对照组123.57±3.75132.96±7.09134.36±3.83空白纳米组59.83±12.4186.38±4.49101.45±1.79ng/L2.4.3ASPS-NE对雏鸡血清中IFN-γ表达量的影响（见表7）由表7可知，与空白对照组相比，三次免疫后，各ASPS-NE组雏鸡血清中IFN-γ表达量均极显著升高（P0.01）。与空白纳米组相比，35 d时，ASPS-NE（L）组和ASPS-NE（M）组雏鸡血清中IFN-γ表达量极显著升高（P0.01）；二次免疫和三次免疫后，ASPS-NE（H）组雏鸡血清中IFN-γ表达量极显著升高（P0.01）。与纯疫苗组相比，35 d时，ASPS-NE（L）组雏鸡血清中IFN-γ表达量显著升高（P0.05），ASPS-NE（M）组雏鸡血清中IFN-γ表达量极显著升高（P0.01），28、35 d时，ASPS-NE（H）组雏鸡血清中IFN-γ表达量极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.010.T007表7ASPS-NE对雏鸡血清中IFN-γ表达量的影响组别21 d28 d35 dASPS-NE（L）组75.85±3.55C119.69±3.74C168.99±15.37aBCASPS-NE（M）组100.11±11.50C148.47±5.25aC188.81±7.40ABCASPS-NE（H）组96.42±3.74C161.02±6.00ABC153.41±30.61ABC纯疫苗组71.44±5.38107.94±2.0087.64±47.35空白对照组15.99±1.0333.28±0.58115.67±81.44阳性对照组87.64±10.45149.82±6.69143.18±40.68空白纳米组64.28±3.51110.68±13.39112.46±12.13ng/L3讨论3.1ASPS-NE对雏鸡生长性能的影响刺五加多糖可以调节肠道菌群，提高断奶仔猪的生长性能[16]。叶建萍等[17]研究表明，ASPS提取物可提高肉鸡的生长性能和屠宰性能。本试验中，ASPS-NE可提高肉鸡的平均日增重，降低料重比，其中以中剂量ASPS-NE对雏鸡生长性能的改善效果明显。3.2ASPS-NE对雏鸡体内血清IBDV抗体水平的影响本试验参考鲁振国等[18]方法检测鸡血清中IBDV抗体水平，二免后抗体水平出现较大提高，而且可以维持较高水平。翟旭楠等[19]研究发现，ASPS作为免疫佐剂能够增强对小鼠体内巨噬细胞的吞噬功能。田艳[20]研究发现，灵芝多糖制成纳米乳后与灭活抗原配合可发挥免疫增强作用，与张英楠[21]发现ASPS能够增加正常免疫雏鸡和环磷酰胺免疫抑制雏鸡的ND-HI抗体效价的结果类似。3.3ASPS-NE对鸡免疫器官指数的影响免疫器官重量相对增加，表明机体的免疫器官的功能增强[22]。本试验中，ASPS-NE配合鸡法氏囊灭活疫苗使用能够促进提高脏器指数，提高机体免疫机能，与张英楠等[23]、闫雪等[24]报道ASPS能够提高胸腺、法氏囊和脾脏器官指数以及体重的结果类似。3.4ASPS-NE对雏鸡血清中细胞因子表达的影响Thl类细胞因子包括IL-2、IL-12、IFN-γ等，可诱导细胞免疫，Th2类细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10等，是B细胞生长和分化的主要因子[25]。本研究发现，ASPS-NE配合鸡法氏囊灭活疫苗使用，IL-2、IL-4、IFN-γ表达量比单独使用鸡法氏囊灭活疫苗时有了较大提高，表明刺五加多糖纳米乳作为一种免疫佐剂可发挥免疫增强作用。张英楠等[26]报道，ASPS能够提高鸡淋巴细胞的体外增殖功能，促进Th1和Th2细胞因子分泌，与本试验结果一致。闫雪等[24]研究发现，ASPS可以提高T细胞增殖活性和IL-2水平，增强雏鸡免疫功能。4结论本研究结果表明，刺五加多糖纳米乳作为鸡法氏囊灭活苗的免疫佐剂具有提高雏鸡生长性能和免疫促进作用，且浓度64 g/L时免疫增强效果较好。