霉菌属于真菌，在自然环境中广泛分布，平均每年因霉变而损失的粮食大约是粮食总产量的10%。霉菌能够破坏饲料原有的营养价值，部分霉菌所产生的毒素还会对动物的组织与器官造成严重危害[1-2]。霉菌孢子在环境中可存活较长时间，在湿度大于85%、温度超过25 ℃，霉菌就会开始快速、大量地生长繁殖并产生毒素。奶牛的TMR含有较高的水分，在高温时容易发生有氧变质及霉变，从而降低TMR的营养价值，影响日粮适口性，对反刍动物的健康产生不利影响，降低动物的生产性能。生物饲料是由混合菌种经发酵后产生的具有生物活性物质的一类饲料产品。本课题组前期试验结果显示，经混合菌种（乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌）发酵制成的生物饲料可抑制TMR中的霉菌生长，改善TMR有氧稳定性[3]。乳酸菌可分泌具有抗真菌活性的物质[4-6]，枯草芽孢杆菌对霉菌毒素也具有降解作用[7-8]。本试验研究不同发酵菌种对生物饲料和加入生物饲料的TMR的霉菌生长的影响，为开发功能性生物饲料提供参考。1材料与方法1.1试验材料枯草芽孢杆菌（1.0×108 CFU/g，保藏号：CGMCC NO.13131）、酿酒酵母菌（2.0×108 CFU/g，保藏号：CGMCC NO.13133）及植物乳杆菌（1.0×108 CFU/g，保藏号：CGMCC NO.13132），均由生物饲料开发国家工程研究中心提供。孟加拉红培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。1.2生物饲料制备生物饲料发酵的菌种组合见表1。菌粉按0.1%比例添加至基础饲粮中，对照组不添加菌种，基础饲粮组成及营养水平见表2，在25 ℃恒温库中经过单向呼吸阀袋中发酵6 d进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T001表1生物饲料发酵的菌种组合组别枯草芽孢杆菌酿酒酵母菌植物乳酸菌处理1组402040处理2组67330处理3组50050处理4组03367处理5组10000处理6组01000处理7组00100%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T002表2基础饲粮组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.0玉米14.0水分34.20豆粕14.8粗蛋白质19.80麸皮15.1粗灰分4.79玉米皮10.0粗纤维10.89干玉米酒精糟6.0钙0.22枣粉10.0总磷0.61糖蜜5.0喷浆玉米皮5.0菌粉0.1水20.0%1.3生物饲料霉菌生长试验孟加拉红平板培养基：称取18.3 g孟基拉红培养基于1 000 mL三角瓶中，加入500 mL蒸馏水，121 ℃灭菌20 min倾注于灭菌的90 mm平皿中。对照组样品制备：将未经发酵的饲料底物样品加水，水分调至34%~35%。取各试验组生物饲料和对照组样品0.5 g置于孟加拉红培养平板上，28 ℃恒温培养箱培养，每12 h记录一次霉菌生长情况。霉菌生长以霉菌生长区域面积占平板总面积的百分比计。1.4TMR霉菌生长试验取用新鲜青贮，按照表2组成配制TMR，取TMR样品312 kg，平均分成8组，每组39 kg，对照组不添加生物饲料，试验7个组在TMR中添加按照1.2处理的生物饲料各100 g/kg，混匀，每组13个重复，每个重复3 kg。每组中5个重复进行TMR霉菌生长高温试验（26 ℃），8个重复进行TMR霉菌生长常温试验（13 ℃）。TMR日粮组成及营养水平见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T003表3TMR日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.0玉米青贮50.6干物质/%54.53苜蓿草6.0粗蛋白质/%15.70燕麦草1.2粗脂肪/%5.10压片玉米6.0酸性洗涤纤维/%20.42甜菜颗粒粕2.4中性洗涤纤维/%30.58棉籽3.6代谢能/(MJ/kg)11.34奶牛精料补充料27.7泌乳净能/(MJ/kg)7.32糖蜜2.51.5测定指标及方法1.5.1水分按《饲料中水分的测定》（GB/T 6435—2014）方法测定生物饲料水分。1.5.2pH值称取5.0 g饲料样品于100 mL烧杯，加入45 mL去二氧化碳的蒸馏水，混匀，测定pH值并记录。1.5.3TMR温度将各组3 kg的TMR样品置于15 L敞口聚乙烯塑料桶中，桶口使用双层纱布包裹，防止水分散失，将温度计插入TMR中间表面下10 cm处，记录TMR在有氧暴露过程中温度变化，每24 h记录一次。1.5.4霉菌总数在试验开始后24 h采集各组TMR样品，按《饲料中霉菌总数的测定》（GB/T 13092—2006）测定霉菌总数。1.6数据统计与分析数据采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵菌种对生物饲料发酵水分和pH值的影响（见表4）由表4可知，各组饲料的水分含量均无明显差异（P0.05），水分含量为34.1%~34.7%。与对照组相比，各试验组生物饲料的pH值显著降低（P0.05）；处理3组（枯草芽孢杆菌+植物乳酸菌）生物饲料的pH值为4.39，显著低于其余各组（P0.05）。研究表明，植物乳酸菌能够显著降低生物饲料发酵过程的pH值，且枯草芽孢杆菌与植物乳酸菌存在一定的协同作用，会增强植物乳酸菌的产酸能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T004表4发酵菌种对生物饲料发酵水分和pH值的影响项目处理1组处理2组处理3组处理4组处理5组处理6组处理7组对照组SEMP值水分/%34.6034.7034.3034.2034.3034.2034.1034.400.110.95pH值5.22b5.05d4.39f5.12c5.16c5.27b4.68e5.33a0.640.05注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。处理1组和处理6组生物饲料的pH值为5.22和5.27，显著高于其他试验组（P0.05）。处理4组的生物饲料pH值显著高于处理7组（P0.05），表明酿酒酵母菌会抑制乳酸菌的产酸能力。2.2发酵菌种对生物饲料霉菌生长的影响（见表5）由表5可知，在平板培养36 h后，对照组和处理2组生物饲料开始出现霉菌，其余各组生物饲料在培养84 h后霉菌。在36~108 h期间，对照组生物饲料的霉菌数量均显著高于各生物饲料组（P0.05）。研究表明，饲料经过单一或混合菌种发酵均可以抑制其生长霉菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T005表5发酵菌种对生物饲料霉菌生长的影响时间/h对照组处理组1处理2组处理3组处理4组处理5组处理6组处理7组SEMP值000000000——1200000000——2400000000——3670.00a0b0.20b0b0b0b0b0b4.860.054896.70a0b0.30b0b0b0b0b0b6.670.0560100.00a0c8.50b0c0c0c0c0c6.860.0572100.00a0c17.50b0c0c0c0c0c6.870.0584100.00a3.70c20.00b0c2.00c8.30c10.00bc3.70c6.620.0596100.00a10.00cd25.00b5.50de3.00e12.50c15.00c5.50de6.320.05108100.00a11.70c46.70b8.30c4.30c16.70c20.30bc8.30c6.880.05%试验96 h，处理3组、4组、7组生物饲料霉菌数量最少，显著低于处理5组、6组（P0.05），表明植物乳酸菌是抑制霉菌生长的主要菌种。试验60~84、108 h，处理1组、3组、4组、5组、6组、7组生物饲料的霉菌数量较低，表明酵母菌和枯草芽孢杆菌单独发酵也有一定的抑制霉菌生长的作用。但60 h后，处理2组生物饲料的霉菌生长显著高于其他处理组（P0.05），表明枯草芽孢菌和酿酒酵母菌间存在明显的拮抗作用。2.3发酵菌种对添加生物饲料的TMR霉菌生长的影响2.3.1发酵菌种对添加生物饲料的TMR温度的影响（见表6）由表6可知，高温（26 ℃）环境温度条件下，放置24 h，对照组TMR温度最高，提高了5.8 ℃。48 h，对照组和处理2组TMR温度分别高于环境温度5.3 ℃和3.8 ℃，显著高于其余各处理组（P0.05）。72 h时，各组TMR温度均高于环境温度2 ℃以上，表明各组均发生了有氧变质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T006表6发酵菌种对添加生物饲料的TMR温度的影响（高温26 ℃）时间/h对照组处理1组处理2组处理3组处理4组处理5组处理6组处理7组SEMP值020.8021.3021.6021.4021.2020.9021.4021.500.420.272426.60a24.50b24.40b24.80b24.20b24.50b25.20ab24.40b0.200.054831.30a26.20b29.80a26.30b26.10b26.30b27.50bc26.10b0.420.057235.40a31.30b35.05a31.95b32.15b32.10b32.40b31.80b0.310.059641.10a37.40bc38.50b36.70c38.10bc38.30bc39.00b37.80bc0.280.0512037.2036.2036.3036.1037.0036.9036.8036.900.140.31℃在96 h，各组TMR温度均达到了最高温度，微生物生长达到了峰值，120 h温度则开始降低，降低后的各组TMR温度差异不显著（P0.05）。研究表明，除处理2组外，其余各生物饲料组均可改善TMR的有氧稳定性，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌间存在一定的拮抗作用。2.3.2发酵菌种对添加生物饲料的TMR的pH值和霉菌的影响（见表7）由表7可知，试验24 h，处理3组TMR的pH值最低，处理7组次之，显著低于其他组（P0.05）。研究表明，含植物乳酸菌发酵生物饲料能够显著降低TMR在24 h的pH值，且枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌有协同作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T007表7发酵菌种对添加生物饲料的TMR的pH值和霉菌的影响（高温26 ℃）处理对照组处理1组处理2组处理3组处理4组处理5组处理6组处理7组SEMP值pH值5.12a5.06b5.11a4.92d5.07ab5.09ab5.12a5.00c0.0140.05霉菌/(CFU/g)1 823a116b1 600a440b226b753b643b350b137.10.05在24 h，处理1组、3组、4组、5组、6组、7组TMR的霉菌总数显著低于对照组和处理2组（P0.05）。研究表明，除了处理2组，其余各组均对TMR内部的霉菌生长起一定的抑制作用。2.4发酵菌种对添加生物饲料的TMR有氧稳定性的影响2.4.1发酵菌种对添加生物饲料的TMR温度的影响（见表8）由表8可知，常温（13 ℃）环境温度条件下，在0~72 h，各组TMR的温度均未高于常温2 ℃以上。96 h，对照组TMR温度高于环境温度2.7 ℃发生了有氧变质，而其他各处理组未发生有氧变质。120 h时，对照组、处理2组、5组、6组TMR温度高于常温2 ℃以上，并高于处理1组、3组、4组、7组，添加有植物乳酸菌的TMR处理组温度低于未添加组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T008表8发酵菌种对添加生物饲料的TMR温度的影响（常温13 ℃）时间/h对照组处理1组处理2组处理3组处理4组处理5组处理6组处理7组SEMP值011.6011.3011.3011.4011.1011.4011.4011.400.200.592412.6012.3012.2012.3012.3012.4012.3012.300.220.584812.9012.7012.5012.4012.5012.6012.5012.600.190.977213.5012.1013.2012.2012.2012.4013.1012.200.240.069615.70a12.20b14.30ab12.10b12.20b12.60b13.90ab12.30b0.330.0512019.10a12.90c18.10a13.60bc13.90bc15.30abc17.40ab12.50c0.530.0514420.90a15.40bc20.00ab14.60c14.00c15.80bc17.70abc14.40c0.600.0516816.90a14.80ab16.40ab14.30b14.30ab14.30ab15.80ab14.40ab0.300.05℃研究表明，植物乳酸菌发酵生物饲料添加可提高TMR的有氧稳定性。2.4.2发酵菌种对添加生物饲料的TMR的pH值的影响（见表9）由表9可知，试验24 h，处理3组TMR的pH值最低，处理5组、7组次之，显著低于对照组及处理2组、4组、6组（P0.05）。研究表明，含植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌发酵生物饲料能够显著降低TMR在24 h时pH值，且枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌具有协同作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.023.T009表9发酵菌种对添加生物饲料法人TMR的pH值和霉菌的影响（常温13 ℃）处理对照组处理1组处理2组处理3组处理4组处理5组处理6组处理7组SEMP值pH值5.09ab5.05bc5.11a4.93d5.10a5.04c5.09ab5.02c0.010.05霉菌/(CFU/g)5 867a350b340b280b730b400b300b390b4150.05在24 h，各处理组的霉菌总数显著低于对照组（P0.05），表明生物饲料发酵各组对TMR内部的霉菌生长起一定的抑制作用。3讨论3.1单一菌种抑制霉菌的效果比较近年来，关于益生菌抑制霉菌及降解霉菌毒素的研究逐渐增多，展现了益生菌对霉菌抑制的大潜力。本试验中，饲料经枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌或植物乳酸菌单一菌种发酵后，生物饲料以及TMR中的霉菌生长均受到明显抑制，表明试验所用单一菌种具有抑制中霉菌的生长的作用；植物乳酸菌对霉菌的抑制效果最好，其次是枯草芽孢杆菌，酿酒酵母菌效果最差。关于乳酸菌[9-11]抑制霉菌的研究报道较多，主要的抑菌机理是高浓度的有机酸，乳酸具有抗真菌活性，可以通过破坏膜结构，降低细胞内pH值，抑制主动运输，阻碍部分代谢功能发挥抗真菌活性[12-13]。枯草芽孢杆菌具有抑制黄曲霉菌生长、降解黄曲霉毒素作用，初步认为对黄曲霉毒素降解活性物质是一种胞内分泌物[14]。目前关于拮抗酵母抑制曲霉的生长和毒素产生有一些报道，但研究主要集中在培养基或水果上拮抗菌株对炭黑曲霉的生长和产毒的抑制作用，具体作用机理与机制等方面的研究较少[15]。本试验中，将单一菌种发酵生物饲料按100 g/kg添加至奶牛TMR中，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌单一菌种发酵生物饲料能够显著提升TMR有氧稳定性，酿酒酵母菌发酵生物饲料未能有效提升TMR的有氧稳定性，植物乳酸菌单一发酵生物饲料对提升TMR有氧稳定的效果优于枯草芽孢杆菌发酵饲料。因此，尽管枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和植物乳酸菌单一发酵均可抑制霉菌生长，但植物乳酸菌的效果优于其他两种菌种。目前乳酸菌作为青贮添加剂能够有效提升青贮品质及有氧稳定性[16-17]。3.2菌种组合对霉菌抑制的效果生物饲料多采用混合菌种发酵，通过结合多菌种的优势，使生物饲料达到最佳饲喂效果[18]，但微生物间的相互作用比较复杂，这些作用可归纳为共处、互生、共生、拮抗、竞争和寄生，具有共处、互生和共生关系的微生物共同发酵会对发酵产生正向作用或互不干扰，而具有拮抗、竞争等关系的微生物则会抑制发酵。多菌种混合发酵时要利用不同微生物之间的协同性和互补性，避免拮抗性和竞争性，使其混合后发挥出正组合效应。本试验中，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌或酿酒酵母菌和植物乳酸菌的抑制霉菌的效果均优于单一菌种。表明枯草芽孢杆菌或酿酒酵母菌与植物乳酸杆菌在抑制霉菌效果上具有协同作用。隋明等[19]研究发现，枯草芽孢杆菌可以提高乳杆菌对黄曲霉菌落生长、黄曲霉孢子生长和黄曲霉菌产毒量，两者具有协同作用。姚志芳等[20]研究发现，乳酸菌和酵母菌混合发酵时具有协同和拮抗作用。酵母菌和乳酸菌混合发酵比单一菌种发酵提高各菌数量，但酵母菌代谢产物促进乳酸菌产生更多乳酸，乳酸菌代谢产物抑制酵母菌生长。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌组合的抑菌效果低于单一菌种，表明两者在抑菌效果上存在一定的拮抗作用。李欣等[21]研究表明，枯草芽孢杆菌对酵母生长具有抑制作用。罗远琴等[22]使用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及其复合菌发酵棉粕，枯草芽孢杆菌发酵优于酵母菌及复合菌发酵，但从发酵气味评定，混合菌种发酵优于枯草芽孢杆菌发酵，酵母添加能够提升产品适口性。微生物间相互影响是多菌种混合发酵研究的重要内容，但菌种间的作用并不具有唯一特定的关系，而与发酵环境与发酵目标有关。本试验在发酵袋中进行，因此需氧菌之间会竞争利用氧气表现出拮抗作用，而需氧菌和厌氧菌组合时需氧菌会快速利用氧气为厌氧菌提供适宜的生长环境，进而表现出协同性。因此，在组合菌种发酵对霉菌的抑制效果研究中，需氧菌（枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳酸杆菌）与厌氧菌组合在抑制霉菌和提高TMR有氧稳定性上有协同作用，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的需氧菌组合则表现为拮抗作用。4结论植物乳酸菌是主要抑制霉菌生长的生物饲料发酵菌种，加入酿酒酵母菌或枯草芽孢杆菌，抑制霉菌生长效果更佳，植物乳酸菌和酿酒酵母菌或枯草芽孢杆菌间具有协同作用。无论是两菌发酵还是三菌同时发酵，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌间均具有拮抗作用，不利于生物饲料抑制霉菌生长。