奶牛乳腺炎发病率较高，治愈率低[1]，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失，严重制约了奶牛养殖业的发展[2-3]。大肠杆菌是引起奶牛乳腺炎最常见的病原菌之一[4]，主要包括埃希氏大肠杆菌、克雷伯氏杆菌。诃子在藏族医药的发展中有着“藏药之王”地位，其主要成分包括诃子酸、原诃子酸、诃子素、鞣酸酶和番泻苷A等[5]。药理研究证实，诃子具有抑菌、调节免疫、抑制胃肠蠕动、保护肝脏、收缩血管等功能[6-7]。张腾月等[8]研究单味中药对大肠杆菌的体外抑菌效果和杀菌效果，发现诃子的杀菌效果最强。发酵中药是通过微生物发酵作用将中药制剂进行改良的一类新型药物形式，在畜牧业中应用广泛。与传统中药相比，发酵中药具有提高药物生物利用度、改良药物的适口性、增强药效、促进消化等优势。金海林[9]研究益生菌发酵复方中药产物治疗鸡大肠杆菌病效果，结果表明，发酵中药对大肠杆菌的抑菌作用明显优于未发酵中药。徐汉虹[10]在药用植物固体废渣的生物药肥研制与推广应用中发现，诃子渣通过特有的生防菌进行固-液两相发酵后，具有很强的杀菌作用。本研究观察乳酸菌发酵诃子对大肠杆菌性诱导大鼠乳腺炎的治疗效果，检测大肠杆菌乳腺炎大鼠血清炎性因子水平变化，为研究乳酸菌发酵诃子对奶牛乳腺炎的作用效果提供参考。1材料与方法1.1试验材料大肠杆菌标准菌株（登录号：ATCC25922）。Wistar大鼠由郑州大学提供，体重为（278±50）g。乳酸菌由河南牧业经济学院生物工程系生物技术教研室分离鉴定保存，含菌数2.3×108个/mL。诃子由河南牧业经济学院实验中心提供。1.2主要仪器与试剂高压蒸汽灭菌器、梅特勒电子天平和超净工作台均购自上海值欧净化科技有限公司，YM100Z立式压力蒸汽灭菌器购自上海申安医疗器械有限公司，微量注射器、台式高速离心机、奥林巴斯CX22LED显微镜均购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司。普通肉汤培养基、琼脂肉汤培养基和鲜血琼脂平板购自上海生工生物技术服务有限公司。IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、IL-34和IL-35试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。蒸馏水、葡萄糖溶液、氯化钠注射液和磷酸缓冲液购自河南比根生物科技有限公司，四氧嘧啶购自美国Sigma-Aldrich公司。1.3测定指标及方法1.3.1大鼠乳腺炎模型构建将大肠杆菌在肉汤培养基中培养纯化，采用梯度稀释法[11]将大肠杆菌配成2×107 CFU/mL悬液。选取Wistar大鼠300只（雌性250只、雄性50只），使用杨木刨花垫料饲养。无毒内高温饮水瓶1周消毒2次，2 d换1次饮水，环境温度为21~27 ℃，湿度在50%左右，饲养2周。将雌性和雄性大鼠合笼5 d，分小笼单独饲养，直至大鼠分娩，将大肠杆菌悬液接种于出生4~10 d断奶大鼠；接种前对大鼠挤奶，使用微量注射器将大肠杆菌悬液0.5 mL对称性注入第4乳区，对照组大鼠注射等量灭菌生理盐水。根据大鼠的临床表现、解剖学观察和乳腺组织病理变化衡量乳腺炎模型构造是否成功。1.3.2药物制备发酵诃子制备：准确称取100 g诃子，分别加5倍量和3倍量水，煮沸2次，每次约30 min，分别留取每次滤液，合并2次滤液，浓缩至生药诃子含量0.5 g/mL；取100 mL药液加入250 mL锥形瓶，调整pH值至7.0，121 ℃高压灭菌15 min，待温度降至40 ℃左右，按1%接种量接种乳酸菌菌种，37 ℃静置培养24 h得诃子发酵液。将制备好的发酵诃子（浓度为500 g/L）分别稀释为100、50、25 g/L，标记，取5 mL生药诃子含量0.5 g/mL滤液稀释至50 g/mL标记。1.3.3试验设计将126只建模成功的大鼠随机分为6组，分别为模型组、未发酵诃子组、乳酸菌组、乳酸菌发酵诃子低剂量组、乳酸菌发酵诃子，中剂量组和乳酸菌发酵诃子高剂量组，每组3个重复，每个重复7只大鼠，并将21只正常大鼠作为对照组。大鼠乳腺炎给药途径和剂量见表1，在此期间各组大鼠正常饲养，持续给药21 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.015.T001表1大鼠乳腺炎给药途径和剂量组别数量/只给药途径剂量次数对照组21灌胃生理盐水20.00 mL/g2次/d模型组21灌胃生理盐水20.00 mL/g2次/d未发酵诃子组21灌胃未发酵诃子1.30 mg/g2次/d乳酸菌组21灌胃0.5‰乳酸菌2次/d乳酸菌发酵诃子低剂量组21灌胃乳酸菌发酵诃子0.65 mg/g2次/d乳酸菌发酵诃子中剂量组21灌胃乳酸菌发酵诃子1.30 mg/g2次/d乳酸菌发酵诃子高剂量组21灌胃乳酸菌发酵诃子2.60 mg/g2次/d1.3.4大鼠乳腺炎治愈率大鼠全身症状消失，乳区肿块消失，由硬变软，奶样无肉眼可见变化，在给药治疗21 d，147只大鼠全部解剖，肉眼和病理组织学观察进行综合评定，心脏采血分离血清-20 ℃冰箱冷冻保存。治愈率=痊愈数/样本数(1)1.3.5血清炎症指标检测采用ELISA法对大鼠血清中的炎性因子IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、IL-34和IL-35含量进行测定，试验过程中严格按照试剂盒说明书进行操作。1.4数据统计与分析数据采用GraphPad Prism 6软件统计分析，One-way ANOVA分析显著性，LSD法分析组间差异显著性。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1乳酸菌发酵诃子对大鼠乳腺炎临床症状观察结果乳酸菌发酵诃子对大鼠乳腺炎治疗结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.015.T002表2乳酸菌发酵诃子对大鼠乳腺炎治疗结果组别样本数/只痊愈数治愈率/%对照组2121100.00Aa模型组2114.76Dd未发酵诃子组211466.67Cc乳酸菌组211571.43Cc乳酸菌发酵诃子低剂量组211466.67Cc乳酸菌发酵诃子中剂量组211785.71Bb乳酸菌发酵诃子高剂量组211990.48Bb注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05）；不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。试验期间，模型组大鼠出现精神沉郁，饮水和采食量明显减少，口腔和鼻腔有少量分泌物，乳腺组织出现肿胀，第3 d开始有1只大鼠死亡。第15 d，大鼠死亡情况有所好转，第21 d大鼠第4对乳腺肿胀程度减轻，但大部分大鼠乳腺红肿比较明显。治疗组大鼠出现不同程度变化，第3 d大鼠精神状态出现好转，肿胀开始减轻，第7 d开始大鼠乳腺硬块开始减轻，之后大鼠精神状态和乳腺红肿逐渐好转，第21 d，乳酸菌发酵高剂量组大鼠乳腺炎19只基本治愈，2只具有轻微症状；模型组在整个治疗期间共有8只大鼠发生死亡。由表2可知，未发酵诃子组和乳酸菌发酵诃子高、中、低剂量组大鼠治愈率极显著高于模型组（P0.01），未发酵诃子组、乳酸菌组大鼠的治愈率极显著低于乳酸菌发酵诃子中、高剂量组（P0.01）。2.2乳酸菌发酵诃子对大鼠血清中炎性因子含量的影响（见表3）由表3可知，模型组大鼠血清中促炎因子IL-12含量均极显著高于对照组和其他给药组（P0.01）；乳酸菌发酵诃子组大鼠血清IL-12含量极显著低于模型组（P0.01）；乳酸菌发酵诃子低剂量组大鼠血清IL-12含量极显著高于乳酸菌发酵诃子中、高剂量组（P0.01）。研究表明，乳酸菌发酵诃子能够显著降低大肠杆菌乳腺炎大鼠血清中IL-12含量，且乳酸菌发酵中剂量和高剂量效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.18.015.T003表3乳酸菌发酵诃子对大鼠血清中炎性因子含量的影响组别IL-12/(ng/L)IL-17/(ng/L)IL-18/(ng/L)IL-23/(ng/L)IL-34/(ng/L)IL-35/(μg/L)对照组26.15±12.26Dc25.44±1.57Dc20.98±4.70Bc18.75±5.68Ce46.33±0.47De52.51±8.12Aa模型组45.46±9.62Aa44.04±8.59Ab45.68±9.53Aa48.04±0.51Aa94.33±8.84Aa24.39±4.77Cd未发酵诃子组38.42±0.13Bb39.02±3.57Bb40.51±1.45Ab42.74±2.43Ab85.17±9.96Bb27.74±6.76Bc乳酸菌组40.20±8.77Bb40.66±5.22Ba42.43±8.73Ab46.65±9.70Aa86.29±6.47Bb25.74±4.62Bd乳酸菌发酵诃子低剂量组37.52±11.36Cb38.06±12.61Bb39.70±3.91Ab39.08±4.89Bc82.80±9.78Bc27.89±1.26Bc乳酸菌发酵诃子中剂量组28.41±1.34Dc36.08±10.64Cb34.89±12.90Bc35.15±3.88Bd76.11±0.63Cd31.24±0.53Bb乳酸菌发酵诃子高剂量组27.49±0.63Dc35.33±9.88Cb33.88±0.85Bc35.20±2.90Bd76.96±0.16Cd31.97±3.35Bb模型组大鼠血清中促炎因子IL-17含量均极显著高于对照组和给药组（P0.01）；与乳酸菌组相比，未发酵诃子组、乳酸菌发酵低、中、高剂量组血清中促炎因子IL-17含量显著降低（P0.05）。模型组大鼠血清中促炎因子IL-18含量极显著高于乳酸菌发酵诃子中剂量组和乳酸菌发酵诃子高剂量组（P0.01）；与模型组相比，未发酵诃子组、乳酸菌发酵低剂量组、乳酸菌组大鼠血清中促炎因子IL-18含量显著降低（P0.05）；与乳酸菌发酵诃子低剂量组相比，乳酸菌发酵诃子中、高剂量组大鼠血清中促炎因子IL-18含量显著降低（P0.05）。模型组大鼠血清中促炎因子IL-23含量极显著高于乳酸发酵低、中、高剂量组（P0.01），显著高于未发酵诃子组（P0.05）；乳酸菌发酵诃子低剂量组大鼠血清中促炎因子IL-23含量显著高于乳酸菌发酵中、高剂量组（P0.05）。模型组大鼠血清中促炎因子IL-34含量均极显著高于对照组和给药组（P0.01）；与乳酸菌发酵诃子低剂量组相比，乳酸菌发酵中、高剂量组大鼠血清中促炎因子IL-34含量显著降低（P0.05）。模型组大鼠血清中抗炎因子IL-35含量极显著低于乳酸菌发酵诃子低、中和高剂量组（P0.01），显著高于未发酵诃子组（P0.05）。与乳酸菌发酵诃子低剂量组相比，乳酸菌发酵中、高剂量组大鼠血清中抗炎因子IL-35显著升高（P0.05）。研究表明，乳酸菌发酵诃子能够显著提高大肠杆菌乳腺炎大鼠血清中IL-35含量，且中剂量和高剂量组效果显著。3讨论3.1大鼠乳腺炎模型的构建结果分析体外抑菌试验和体内药物试验是衡量药物药效最主要的试验方法，因此使用体内抑菌试验筛选治疗乳腺炎的中药具有重要意义。目前，利用动物病理模型研究疾病的病理变化是最有效的方法之一[12-13]。黄春凤[14]使用小鼠作为试验动物，将临床奶牛场分离的金黄色葡萄球菌注射给小鼠，成功建立了金黄色葡萄球菌乳腺炎模型。钟凯等[15]向大鼠头内注射内毒素，成功建立人工诱导大鼠乳腺炎模型。本试验采用不同浓度大肠杆菌注射液给大鼠第四对乳腺组织进行注射，表明乳腺注射细菌计数在2×105~2×107 CFU/mL可以成功建立大鼠乳腺炎模型。3.2乳酸菌发酵诃子对大鼠乳腺炎治疗临床效果观察结果乳腺炎的治疗方法较多，但是考虑细菌存在耐药性以及动物源性食品安全等因素，因此研究具有抗菌、无耐药性、低毒、抗炎和提高免疫力的中药具有重要意义。本试验采用乳酸菌发酵诃子对大肠杆菌诱导乳腺炎的大鼠进行21 d治疗，治愈率达90.48%，乳酸菌发酵诃子组对缓解大鼠临床症状效果较明显，表明乳酸菌发酵诃子对大肠杆菌性大鼠乳腺炎具有良好的治疗效果。3.3乳酸菌发酵诃子对大肠杆菌乳腺炎大鼠模型血清炎性因子的影响发酵诃子是利用乳酸菌对诃子提取液进行液态厌氧发酵，转化诃子中的有效成分，其中某些大分子物质经微生物乳酸杆菌的发酵后，可转化为更易被肠道吸收的小分子物质，使诃子的有效成分被加速吸收[16]，使发酵诃子具备诃子和乳酸菌的双重作用，让诃子经乳酸菌发酵后的临床效果能得到提高[17]。细菌性乳腺炎是指在致病微生物的作用下导致乳腺组织受到损伤而产生炎症反应，在炎症发生和发展的整个过程中伴随血清炎性因子变化[18]。血清中炎性因子的含量决定乳腺组织中炎症反应的发展、转归和乳腺组织损伤的程度，协调血清中炎性因子的表达量可以在治疗乳腺炎中发挥重要作用[19-20]。本试验采用乳酸菌发酵诃子治疗大肠杆菌感染大鼠乳腺炎，检测治疗21 d后大鼠血清炎性因子IL-12、IL-18、IL-17、IL-35、IL-34和IL-23水平，结果表明，大肠杆菌乳腺炎与血清IL-12、IL-18、IL-17、IL-35、IL-34和IL-23水平呈正相关，表明乳酸菌发酵诃子可通过影响免疫器官和免疫细胞提高机体免疫功能，从而抑制细菌的炎症反应治疗乳腺炎。4结论乳酸菌发酵诃子可显著降大肠杆菌乳腺炎模型大鼠的炎症的发展，治愈率较高，是一种有效的治疗乳腺炎治疗的药物，其机制可能是因为降低了炎症反应中的促炎因子IL-12、IL-18、IL-17、IL-34和IL-23含量，提高抗炎因子IL-35含量，从而调节乳腺炎免疫功能。