目前我国蛋白饲料的进口量超过1亿t，蛋白饲料的短缺已严重影响我国畜牧业的发展。扩大蛋白饲料来源，降低蛋白饲料成本对我国畜牧业具有重要意义。单细胞蛋白（SCP）富含多种营养物质，其中蛋白质含量高达50%~85%，还含有赖氨酸、蛋氨酸等多种必需氨基酸[1-2]，是一种优质的蛋白质代替品。作为发酵过程的第一产物[3]，SCP生产不受季节和气候的影响，在替代蛋白饲料方面具有广阔的应用前景。用于SCP生产的微生物种类较多，产朊假丝酵母是一种较好的工业菌种，其生长速度快、SCP含量高，且富含多种营养物质，被美国FDA认证为安全生物（GRAS），可用作饲料添加剂。产朊假丝酵母在SCP的生产中具有良好的市场前景[4]。为提高产朊假丝酵母菌体蛋白含量，可利用基因重组、定点诱导等现代生物技术以及传统的诱变育种和原生质体融合手段[5]。诱变育种作为一种获得优良菌种的较为普遍且理想的方法，在产朊假丝酵母中的研究较多。王程等[6]通过紫外诱变酿酒酵母得到一株高产SCP的诱变菌株SY-5-7，蛋白含量比出发菌株高7.84%，达到48.67%。重离子辐照诱变具有突变率高、突变谱广、不易回复突变等优点[7-8]，已在微生物诱变育种方面取得不错的效果。马良等[9]利用12C6+对面包酵母进行诱变，得到一株粗蛋白含量达到55%以上的菌株。本研究以产SCP的9株产朊假丝酵母为出发菌株，从生长速度、蛋白质含量、木糖利用情况等多方面进行综合筛选，最终选择的菌株进行12C6+离子束辐照诱变，选育高产SCP的菌种，用于生产蛋白饲料。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1试验菌种产朊假丝酵母（C. utilis CICC32834、C. utilis CICC32618、C. utilis CICC31856、C. utilis CICC31188、C. utilis CICC31494）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。产朊假丝酵母（C. utilis CGMCC2.2878、C. utilis CGMCC2.2951、C. utilis CGMCC2.569、C. utilis CGMCC2.615）购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。1.1.2试验试剂葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取粉、尿素、木糖、(NH4)2SO₄、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、琼脂（国药集团化学试剂有限公司），工业硫酸铵（内蒙古阜丰生物科技有限公司）。1.1.3培养基配制YPD培养基：胰蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母提取粉5 g/L。固体培养基添加2%的琼脂。基础培养基：葡萄糖2 g/L、胰蛋白胨2 g/L、磷酸二氢钾0.1 g/L、七水合硫酸镁0.05 g/L、氯化钠0.01 g/L。发酵培养基：葡萄糖10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、硫酸二氢钾0.1 g/L、七水合硫酸镁0.05 g/L、氯化钠0.01 g/L。上述培养基pH值均为自然，葡萄糖单独115 ℃灭菌30 min，其余成分121 ℃灭菌20 min，使用前混合。1.2试验方法1.2.1菌体生长曲线菌种活化后，以1%的接种量接至YPD液体培养基，30 ℃、180 r/min培养，每隔2 h测定样品的吸光度值（OD600 nm值）。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制菌体生长曲线[10]。1.2.2木糖利用情况将基础培养基中葡萄糖用木糖代替，其余条件不变，于30 ℃、180 r/min培养24 h，以未接种培养基作空白，测定样品的OD600 nm值。1.2.3氮源种类对菌体蛋白含量的影响将基础培养基中胰蛋白胨的氮元素根据等量换算关系，以相同氮含量的硫酸铵、工业硫酸铵、尿素分别代替，其余条件不变，于30 ℃、180 r/min培养24 h，测定样品的OD600 nm值。1.2.4辐照诱变使用中科院近代物理研究所兰州重离子加速器国家实验室的兰州重离子研究装置（HIRFL）进行辐照诱变。将培养至对数期的菌液，分别取2 mL装入无菌辐照皿，封口膜密封，经80 MeV/u的12C6离子束辐照，辐照剂量依次为0、40、80、120、160、200 Gy。每个剂量3个平行，1个空白对照。1.2.5致死率和正突变率的计算将不同剂量的菌液稀释到最适浓度涂布到YPD固体培养基上，30 ℃培养24 h后菌落计数，计算致死率。致死率=1-(辐照组辐照后长出的菌落数/对照组长出的菌落数×100%)(1)将诱变后的菌液稀释至最适浓度，吸取菌液40 μL，在YPD固体培养基上涂布，30 ℃培养36~48 h。挑选菌落直径较大的菌落转接至YPD液体培养基，于30 ℃、180 r/min培养48 h，测定OD600 nm，高于原始菌株的计为正突变株。1.2.6初筛对不同剂量诱变处理后的菌液，稀释至最佳梯度10-6，吸取菌液40 μL，滴加至YPD固体培养基上均匀涂布，倒置培养36~48 h。挑选出菌落直径大的菌落转接至YPD液体培养基培养48 h，通过测定菌液吸光度值（在波长600 nm处的OD值）判断菌体活性，选出活性较大及菌体蛋白较高的菌株留待复筛。1.2.7复筛将初筛的菌种接于YPD液体培养基，30 ℃、180 r/min培养48 h。测定菌体生物量和菌体蛋白含量，以蛋白含量的高低作为复筛的依据。1.2.8菌体生物量及蛋白含量的测定将菌悬液在8 000 r/min离心5 min，弃去上清液，采用无菌水洗涤菌体3次，倒去上清，90 ℃烘至恒重，测定其质量。根据GB/T 6432—2018方法检测蛋白含量。粗蛋白质=(V2-V1)×c×0.014 0×6.25m×V'/V×100 (2)式中：V2表示滴定样品消耗的标准盐酸溶液体积（mL）；V1表示空白对照所需的标准盐酸溶液体积（mL）；c表示标准盐酸溶液的浓度；m表示试样的质量（g）；V表示试样消解液总体积（mL）；V'表示蒸馏用消解液体积（mL）；0.014 0表示每毫克当量氮的克数；6.25表示氮换算成蛋白质的平均系数。1.2.9菌株高产蛋白性能稳定性分析将复筛得到的菌种连续培养12代，每隔2代测定其SCP的含量，培养条件与测定方法同1.2.7。1.3数据统计与分析试验数据采用SAS 9.4进行方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1出发菌株的选择2.1.19株产朊假丝酵母菌的生长曲线（见图1）由图1可知，9株产朊假丝酵母生长趋势基本一致，即在0~4 h为菌株生长的延迟期；在4~20 h，菌株OD值大幅增加，表明菌株进入对数期；在20 h后菌株生长趋势平缓进入稳定期。通过生长曲线测定可判断不同菌株的生长代谢规律，以便更好地调控发酵过程及确定最佳接种时间等。在相同培养条件下，菌株生长速度越快，表明其对营养物质利用越好，在应用上越具有优势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.F001图19株产朊假丝酵母菌的生长曲线2.1.2不同氮源对产朊假丝酵母的OD600 nm值的影响9株酵母菌初始OD600 nm值均在0.038~0.055之间，不同氮源对9株产朊假丝酵母发酵24 h的OD600 nm值的影响见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T001表1不同氮源对产朊假丝酵母的OD600 nm值的影响菌株胰蛋白胨硫酸铵工业硫酸铵尿素2.28780.957±0.004Aa0.740±0.006Bb0.760±0.001Bb0.319±0.030Cc2.29510.899±0.039Aa0.665±0.018Bb0.734±0.028Bb0.241±0.007Cc2.5690.924±0.029Aa0.661±0.002Bb0.759±0.054ABb0.258±0.006Cc2.6150.914±0.003Aa0.751±0.021Bb0.757±0.018Bb0.172±0.009Cc318560.859±0.018Aa0.707±0.005Bb0.671±0.008Bb0.166±0.011Cc311880.911±0.055Aa0.658±0.022Bb0.756±0.038Bb0.146±0.013Cc314940.884±0.022Aa0.701±0.016Bb0.662±0.005Bb0.139±0.005Cc326180.856±0.061Aa0.645±0.033Ab0.728±0.025Aab0.109±0.007Bc328340.832±0.021Aa0.747±0.002Ab0.744±0.015Ab0.204±0.008Bc注：1.24 h的OD600 nm值均稀释到相同的倍数。因分析纯硫酸铵和工业硫酸铵纯度不同，添加时需要换算（工业硫酸铵纯度为80%）。2.同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表1可知，无机氮和有机氮均能够被产朊假丝酵母利用，9株产朊假丝酵母在硫酸铵和工业硫酸铵中均生长良好，二者差异不显著（P0.05），当以工业硫酸铵为唯一氮源时，Candida utilis CGMCC2.2878生长最好。在企业生产中，由于工业硫酸铵价格为900元/t，硫酸铵24 000元/t，考虑到实际生产成本问题，选择以工业硫酸铵利用效果作为菌株筛选的指标。2.1.3不同碳源对产朊假丝酵母的OD600 nm值的影响（见表2）由表2可知，9株产朊假丝酵母在葡萄糖和木糖中均能够生长，当以木糖为唯一碳源时，Candida utilis CGMCC2.2878生长最好。玉米皮中纤维素占33.90%，半纤维素占21.83%，粗蛋白占11.64%，淀粉占8.79%，还有一些糖类。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T002表2不同碳源对产朊假丝酵母的OD600 nm值的影响菌株葡萄糖木糖2.28780.957±0.004A0.589±0.007B2.29510.899±0.039A0.223±0.016B2.5690.924±0.029A0.261±0.001B2.6150.914±0.003A0.138±0.002B318560.859±0.018A0.381±0.015B311880.911±0.055A0.276±0.004B314940.884±0.022A0.284±0.012B326180.856±0.061A0.253±0.005B328340.832±0.021A0.316±0.008B在玉米皮发酵生产菌体蛋白饲料的研究中，产朊假丝酵母与其他纤维素降解菌混合培养，既可将玉米皮中的半纤维素和纤维素降解的木糖和葡萄糖作为碳源供酵母菌生长利用，又达到改善饲料原料的适口性使其易被消化以及提高营养价值的目的[10]。因此，菌株筛选以木糖利用效果作为菌株筛选的指标。2.1.4产朊假丝酵母的生物量和蛋白含量（见表3）由表3可知，9株酵母菌的蛋白含量均在45%~60%之间，Candida utilis CGMCC2.2951蛋白含量最高，为57.85%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T003表3产朊假丝酵母的生物量和蛋白含量菌株生物量/(g/L)蛋白含量/%2.28785.800±0.00452.290±1.0522.29516.040±0.00157.850±1.4072.5696.330±0.01753.450±1.4052.6155.420±0.00257.610±1.491318565.650±0.01554.070±0.995311885.380±0.01555.700±1.285314945.340±0.01148.560±1.013326186.420±0.00353.390±1.409328345.710±0.00754.100±1.0182.1.5产朊假丝酵母菌用于生产SCP潜质排名（见表4）考虑到试验目标以菌株蛋白含量为主，木糖和工业硫酸铵利用能力为次要，故采用加权平均数的方法对9株产朊假丝酵母进行评价。由表4可知，在9株产朊假丝酵母中，Candida utilis CGMCC2.2878排名第一，表明其在木糖、工业硫酸铵利用及SCP含量综合评分最好，确定为后续诱变育种的出发菌株。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T004表4产朊假丝酵母菌用于生产SCP潜质排名菌株木糖利用能力无机氮利用能力蛋白含量/%加权平均数排名2.28780.589±0.0070.760±0.00152.290±1.0520.5912.29510.223±0.0160.734±0.02857.850±1.4070.5322.5690.261±0.0010.759±0.05453.450±1.4050.5052.6150.138±0.0020.757±0.01857.610±1.4910.487318560.381±0.0150.671±0.00854.070±0.9950.523311880.276±0.0040.756±0.03855.700±1.2850.514314940.284±0.0120.662±0.00548.560±1.0130.468326180.253±0.0050.728±0.02553.390±1.4090.496328340.316±0.0080.744±0.01554.100±1.0180.514在蛋白饲料生产中，玉米皮中半纤维素降解为木糖，且由表2可知，酵母在以木糖为唯一碳源时的生长情况差异较大，赋予0.3的权重；酵母菌对硫酸铵、尿素等无机氮均能够利用。且由表1可知，9株酵母在以硫酸铵为唯一氮源时的生长情况差异不大，则赋予0.2的权重；试验以筛选高蛋白含量菌株为主要目标，则对蛋白含量情况赋予0.5的权重。设计加权平均数=0.3A+0.2B+0.5C（A为木糖利用，B为工业硫酸铵利用能力，C为蛋白含量）对9株产朊假丝酵母进行综合评分选择最优的菌株。2.2产朊假丝酵母菌CGMCC2.2878致死率和正突变率（见图2）由图2可知，随着辐照剂量的增加，Candida utilis CGMCC2.2878致死率曲线随着辐照剂量的增大呈先增大后降低，呈典型的马鞍形，当辐照剂量为120 Gy时，致死率最大，为77.67%；正突变率在120 Gy时最高，为28%。当低剂量的重离子辐照产朊假丝酵母时，细胞内DNA会受到损伤致使双键断裂，致死率增大[11]。但随着辐照剂量的增加，细胞及其损伤DNA又在其修复系统的作用下能够得到不同程度的修复，所以致死率逐渐降低[12]。同时，随着辐照剂量和致死率的变化，DNA的损伤程度也随之改变，致使菌株易产生正负突变。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.F002图2产朊假丝酵母菌CGMCC2.2878致死率和正突变率2.3诱变菌株初筛及复筛2.3.1产朊假丝酵母CGMCC 2.2878初筛（见表5）从2 650株中筛选出26株比原菌株直径大的菌株，液体培养结果见表5，将筛选出20株诱变菌株用作进一步的复筛。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T005表5初筛菌落直径及OD600 nm值辐照强度/Gy编号直径/mmOD600 nm值（稀释9倍）0Y-1-15.80.84240Y-2-16.10.933Y-2-26.01.062Y-2-36.00.975Y-2-45.90.95980Y-3-17.00.865Y-3-26.80.874Y-3-36.90.870Y-3-46.10.838120Y-4-16.10.848Y-4-27.30.848Y-4-36.80.821Y-4-46.70.876Y-4-57.10.955Y-4-67.10.884Y-4-77.80.829Y-4-87.00.866Y-4-97.00.884Y-4-106.00.80010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T006续表5　初筛菌落直径及OD600 nm值辐照强度/Gy编号直径/mmOD600 nm值（稀释9倍）160Y-5-16.00.880Y-5-27.00.896Y-5-36.10.850200Y-6-16.20.872Y-6-26.30.852Y-6-37.10.858Y-6-47.20.8442.3.2产朊假丝酵母CGMCC 2.2878复筛（见表6）由表6可知，正突变的5株诱变菌株的蛋白含量较出发菌株均具有不同程度的提高。辐照剂量达到120 Gy时，得到1株蛋白含量最高的正突变菌株，将其命名为Y-4-2，其蛋白含量达到63.06%，与出发菌株蛋白含量52.29%相比提高了20.60%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.T007表6复筛菌落生物量及其在发酵液中酵母蛋白含量辐照强度/Gy编号生物量/(g/L)蛋白含量/%0Y-1-13.75352.2940Y-2-13.27758.45Y-2-23.89052.52Y-2-32.53752.32Y-2-43.59149.9780Y-3-13.49550.57Y-3-23.46853.68Y-3-33.52746.49120Y-4-13.56048.90Y-4-23.61363.06Y-4-43.43347.37Y-4-53.50050.31Y-4-63.62450.25Y-4-83.49345.02Y-4-93.46146.02160Y-5-13.52947.99Y-5-23.65849.43200Y-6-13.56247.70Y-6-23.42345.32Y-6-33.50849.23Y-6-43.49750.54近年来，已有利用诱变选育出高产蛋白酵母菌并运用于发酵进行生产的相关研究。如马良[13]利用重离子对面包酵母YB进行诱变，得到1株粗蛋白含量达到55%以上的G1006酵母菌株。并以甜高粱汁作为原料，利用G1006酵母菌株采用单批次及流加发酵技术进行100 L发酵罐生物量积累试验，结果发现，G1006高氮酵母菌粗蛋白含量提高，在工业化生产中具有较高的应用价值。同时，产朊假丝酵母也可直接作为发酵菌种，如何海燕等[14]、王雅波等[15]、Zhou等[16]通过固态发酵提高蛋白含量并投入到生产。2.4诱变菌株Y-4-2遗传稳定性测试结果（见图3）由图3可知，菌株Y-4-2的SCP含量约63%，通过差异显著性分析可知，传代12次菌株的SCP含量差异不显著（P0.05），表明菌株Y-4-2产SCP的性能具有良好的稳定性。通过性能稳定性分析可知，重离子辐照对产朊假丝酵母具有很高的遗传突变效应[17]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.016.F003图3诱变菌株Y-4-2遗传稳定性测试结果3讨论在饲料生产中，菌种的选择至关重要，需根据不同的原料选择不同的菌种进行发酵。在以玉米皮为原料生产的蛋白饲料中，筛选出可高效利用木糖、氮源且具有较高蛋白含量的菌株非常关键。产朊假丝酵母繁殖速度快，菌体蛋白含量高，且能够较好地同化基质碳源和无机氮源，是良好的饲料添加剂。本研究通过对9株产朊假丝酵母进行木糖利用能力比较时发现，9株酵母菌均能够在以木糖为唯一碳源培养基中生长，表明产朊假丝酵母可利用木糖，与盖伟东等[18]的研究结果一致。本研究通过比较9株酵母对不同氮源的利用情况发现，菌株在有机氮源中生长情况明显优于无机氮源。其中，以无机氮为唯一氮源时，9株菌工业硫酸铵和分析纯硫酸铵利用情况无差异但均优于尿素。在实际生产中，在保证产量最大化的同时控制生产成本也很重要。考虑到两种硫酸铵的价格，一吨工业硫酸铵价格约为分析纯硫酸铵的1/25，故在实际生产中以工业硫酸铵为氮源更适合。此外，本研究考虑到试验目标以菌株蛋白含量为主，木糖和工业硫酸铵利用能力为次，故对不同影响因素赋予不同的权重，采用加权平均数的方法，系统地对9株产朊假丝酵母进行评分，筛选出Candida utilis CGMCC2.2878为后续诱变育种的出发菌株。本筛选方法在确定后续诱变育种的出发菌株的同时，也客观评价了不同筛选条件对试验目标的影响。因此，此方法可运用于今后菌株筛选的研究。诱变育种是一种高效筛选优良菌株的方式，本研究利用重离子诱变，通过比较原始菌株和诱变菌株的菌落直径和发酵48 h的OD600 nm值进行初筛，发现菌落大小与蛋白含量无直接关联，与马霞飞等[19]研究结果一致。结果表明，筛选高产蛋白菌株时不能仅依靠菌落大小，必须以菌株蛋白含量确定高产蛋白菌株。因此，在今后的研究中需要探究高产蛋白含量菌株的筛选方法，以期获得高效、快速且准确的筛选方法。重离子诱变是一种获得高产蛋白菌株的有效方法，本研究得到一株高产蛋白菌株，蛋白含量达到63.06%，与原始菌株蛋白含量52.29%相比，菌株蛋白含量提高了20.60%。不同诱变方式诱变效果也不同，如何东东[20]通过对产朊假丝酵母紫外诱变，得到蛋白含量为31.4%的诱变菌株，较原始菌株22.9%提高了37.1%。王治业[21]利用重离子辐照对产朊假丝酵母进行诱变，筛选得到一株产蛋白较高的菌株，蛋白含量达到38.26%，较诱变前19.99%提高了41.3%。本研究产朊假丝酵母经重离子诱变后蛋白含量显著提高，表明用重离子诱变筛选高产蛋白产朊假丝酵母具有可行性。4结论本研究通过对9株产朊假丝酵母出发菌株生长速度、木糖利用、工业硫酸铵利用及蛋白含量的综合评分，筛选出1株综合性能较好的菌株，为Candida utilis CGMCC2.2878。通过重离子辐照诱变育种得到一株遗传性状稳定的产朊假丝酵母突变菌株Y-4-2，其SCP含量较出发菌株提高了20.60%。通过性能稳定性试验发现，连续传代12次后该突变株SCP含量变化幅度不显著，表明其拥有稳定的遗传性能，可用于发酵玉米皮生产菌体蛋白饲料。