羽毛粉是一种将家禽的羽毛水解、干燥、粉碎而获得的高蛋白饲料原料[1]。羽毛粉的蛋白质含量约为77.9%[2]，氨基酸含量丰富，尤其是含硫氨基酸含量高于其他饲料原料，且含有维生素、矿物质元素、多肽类[3]以及一些未知的生长因子。羽毛粉可以替代部分蛋白饲料在动物生产中应用，对动物生产性能具有积极影响[4-7]。我国年产生羽毛100万t[8]，开发和生产饲用羽毛粉可缓解我国蛋白饲料匮乏的现状。研究表明，毛细血管中药物浓度可直接影响动物毛发中的药物浓度[9-10]。动物吸收的药物通过血液扩散至毛发细胞，在毛发细胞角质化的同时，药物与毛发中的蛋白质紧密结合被长期保存。金刚烷胺是禁用药，对人体健康与环境安全均可产生不良影响[11]，但也是鸡类养殖过程中主要的抗病毒药物[12]。被金刚烷胺污染的羽毛所生产的羽毛粉将影响饲料卫生安全。因此，试验拟建立测定羽毛粉中金刚烷胺的方法，为羽毛粉中金刚烷胺的检测提供参考。1材料与方法1.1试剂与材料甲醇（色谱级，Merck公司）、乙腈（色谱级，Merck公司）、甲酸（迪马科技）、甲醇中金刚烷胺标准储备液（100 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司）、甲醇中金刚烷胺-D15标准储备液（100 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司）、Oasis PRiME HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL，Waters公司）、Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL，Waters公司）、PTFE滤膜（上海安普实验科技股份有限公司）。0.2 mol/L盐酸溶液：准确量取18.2 mL盐酸，纯水稀释并定容至1 000 mL。0.1%甲酸溶液：准确量取1 mL甲酸，纯水稀释并定容至1 000 mL。10%甲醇溶液：准确量取10 mL甲醇，纯水稀释并定容至100 mL。准确量取1 mL甲醇中金刚烷胺标准储备液，甲醇稀释并定容至100 mL，得到浓度为1.0 mg/L的外标中间液，准确量取外标中间液1 mL，用甲醇稀释并定容至10 mL，得到浓度为100 μg/L的外标使用液。准确量取1 mL甲醇中金刚烷胺-D15标准储备液，甲醇稀释并定容至100 mL，得到浓度为1.0 mg/L的内标中间液。准确量取内标中间液1 mL，甲醇定容至10 mL，得到浓度为100 μg/L的内标使用液。准确量取适量外标使用液和内标使用液，用10%甲醇溶液配制标准工作液，外标质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，内标质量浓度为10 μg/L。1.2仪器设备UPLC-Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪（Waters公司）、TGL-20M高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）、Multi Reax多点涡旋振荡器（Heidolph公司）、SB-5200DT超声波发生器（宁波新芝生物科技股份有限公司）、SPT-H氮空吹扫仪（北京斯珀特科技有限公司）、VM12固相萃取装置（天津博纳艾杰尔科技有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1样品制备取羽毛粉样品，混匀，粉碎，密封。准确称取羽毛粉样品0.50 g到50 mL离心管，加入内标使用液0.1 mL，加入5 mL 0.2 mol/L盐酸溶液，混匀，65 ℃恒温水浴锅中保持2 h，取出。加入10 mL乙腈，涡旋1 min，超声提取10 min，加入氯化钠5 g，涡漩1 min，10 000 r/min离心10 min得上清液，上清液过PRiME HLB固相萃取柱，滤液于60 ℃吹干，准确量取10%甲醇溶液1 mL，溶解残渣，混匀，0.22 μm滤膜过滤，仪器测定。1.3.2仪器条件1.3.2.1超高效液相色谱条件色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm×1.7 μm）；柱温40 ℃；进样体积1 μL；流动相A：0.1%甲酸溶液，流动相B：甲醇。流动相洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.T001表1流动相洗脱程序时间/min流动相体积分数/%流速/(mL/min)A 0.1%甲酸溶液B甲醇09550.32.09550.34.040600.35.040600.35.59550.37.09550.31.3.2.2质谱条件电喷雾离子源：ESI+；检测方式：MRM；电喷雾电压：3.5 kV；雾化气温度：400 ℃；驻留时间：0.106 s。化合物保留时间及质谱参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.T002表2化合物保留时间及质谱参数化合物保留时间/min母离子子离子锥孔电压/V碰撞能/V金刚烷胺4.46152.00135.10302693.103026金刚烷胺-D154.43167.00150.2014282结果与分析2.1仪器条件优化结果金刚烷胺和金刚烷胺-D15分子中带有氨基基团，质谱检测时，该化合物容易得到H+，带正电荷[13]，故质谱扫描过程中监测ESI正离子。将0.5 mg/L的金刚烷胺和金刚烷胺-D15注射到质谱内，优化得到待测化合物的子离子及相应的质谱条件。选m/z 135.10和m/z 93.10作为金刚烷胺的子离子，与GB 31660.5—2019[14]中选择的子离子相同。子离子中信号更强、更稳定的m/z 135.10作为定量离子，m/z 93.10作为定性离子。质谱的精确度和灵敏度与驻留时间相关[15]。试验设定驻留时间为0.106 s时，此时金刚烷胺具有良好的峰形。超高效液相色谱使用通用型BEH C18色谱柱，流动相中添加甲酸，保证金刚烷胺具有良好的保留重现性[16]，且采用梯度洗脱使金刚烷胺在质谱中得到良好的响应值。金刚烷胺出峰后，采用大比例有机相冲洗色谱柱，避免羽毛粉中的大分子蛋白累积在色谱柱中，导致色谱柱分离效果下降。试验设定色谱柱的柱温为40 ℃，避免环境温度的变化影响待测化合物的保留时间。设定进样体积为1 μL，随着进样量的增加色谱峰的峰形越来越差，导致样品中金刚烷胺的保留时间与标准溶液中的保留时间略有不符。金刚烷胺标准溶液（10 μg/L）、空白样品和阳性添加试样（10 μg/kg）的超高效液相色谱-串联质谱的图谱见图1~图3。图1金刚烷胺标准溶液特征离子图谱（10 μg/L）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F1a1（a）子离子（152135.1）图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F1a2（b）子离子（15293.1）图2空白样品特征离子图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F2a1（a）子离子（152135.1）图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F2a2（b）子离子（15293.1）图谱图3阳性添加样品特征离子图谱（10 μg/kg）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F3a1（a）子离子（152135.1）图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F3a2（b）子离子（15293.1）图谱2.2样品预处理条件优化结果2.2.1水解条件选择金刚烷胺被羽毛粉中蛋白质紧密包裹，应先水解破坏羽毛的结构，将金刚烷胺转变成游离态。酸水解法、碱水解法和酶水解法是检测方法中常见的水解方法[17-19]，其中酶水解法可得到游离态化合物最有效的方法，但酶解条件要求严格、成本高。碱水解法药物释放完全，但提取过程需要调节pH值。使用0.2 mol/L盐酸溶液水解羽毛粉条件简单，用时短，不影响后续的提取过程。2.2.2提取条件的选择试验比较了甲醇、乙腈两种常用的提取试剂，结果显示使用乙腈提取液比甲醇更干净，原因是乙腈具有更强的沉淀蛋白的效果[20]，且甲醇提取液吹干耗时长[21]。向乙腈中加入乙酸或与2%的三氯乙酸配合使用，未提高金刚烷胺的回收率。因此，试验选用纯乙腈作为提取试剂。提取液中加入无水硫酸钠，实现盐析作用，离心得到更加干净的上清液，为后续的过柱和吹干提供便利。2.2.3净化条件的选择使用MCX固相萃取柱净化金刚烷胺效果理想[22-24]。本试验将PRiME HLB固相萃取柱的净化效果与MCX固相萃取柱进行比较。使用MCX固相萃取柱时，将提取液在60 ℃下氮气吹干，用3 mL 2%的甲酸溶液溶解残渣待净化。依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取柱，待净化液过柱，依次用3 mL 2%的甲酸溶液和3 mL甲醇淋洗，抽干固相萃取柱，洗脱液是6 mL的 5% 氨水甲醇溶液，收集的洗脱液60 ℃吹干，准确量取10%甲醇溶液1 mL，溶解残渣并混匀，0.22 μm滤膜过滤，仪器测定，MCX固相萃取柱净化液中特征离子图谱图4。图4MCX固相萃取柱净化液中特征离子图谱（10 μg/kg）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F4a1（a）子离子（152135.1）图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F4a2（b）子离子（15293.1）图谱由图4可知，使用PRiME HLB固相萃取柱净化时定量离子（m/z 135.10）的响应值更强，且净化效果更好。该固相萃取柱使用了改进的筛板[25]，提取液通过顺利，用时少。2.3方法学验证结果2.3.1线性范围与检出限金刚烷胺标准工作液的浓度范围为0.5~50.0 μg/L，采用内标法，将金刚烷胺的浓度作为横坐标，将金刚烷胺定量离子（m/z 135.10）的峰面积与内标金刚烷胺-D15子离子（m/z 150.20）的峰面积之比作为纵坐标，绘制标准曲线：y=0.315 96x＋0.008 52。检验方法标准曲线见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F005图5检验方法标准曲线由图5可知，该曲线的相关系数为0.999 7，线性良好。在空白羽毛粉中逐级减少加入金刚烷胺的水平，样品经水解、提取、净化和浓缩，进行定量分析，方法的定量限和检出限通过色谱峰的信噪比确定[26]，大于10倍信噪比作为定量限，定量限为2 μg/kg，大于3倍信噪比时作为检出限，检出限为1 μg/kg。2.3.2准确度与精密度结果在空白羽毛粉中添加金刚烷胺，添加水平分别为2.0、5.0和10.0 μg/kg，参照试验方法进行处理和测试，每个水平重复测试3次，羽毛粉中金刚烷胺的回收率和精密度见表3。由表3可知，方法平均回收率为98.9%~107.2%，相对标准偏差为3.23%~4.67%，本方法准确度和精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.T003表3羽毛粉中金刚烷胺的回收率和精密度添加浓度/(μg/kg)测定值/（μg/kg）回收率/%平均回收率/%精密度/%2.02.24112.0107.24.672.04102.02.15107.55.05.07101.4100.73.235.18103.64.8697.210.09.7797.798.93.3510.26102.69.6396.32.4基质效应结果样品前处理得到的待测溶液中仍然存在杂质，使用空白基质和10%甲醇溶液分别稀释，配制标准工作液，计算二者的斜率以检测基质效应[27]。结果显示：空白羽毛粉待测溶液对金刚烷胺存在一定程度的基质抑制效应。为使检测结果更加可靠，试验采用内标法定量，使用金刚烷胺-D15作为内标化合物。使用内标校正后，基质曲线与校准曲线斜率比值为85%~110%，满足方法要求[28]。3结论本试验建立了羽毛粉中金刚烷胺含量的检测方法，该方法耗时短，操作简单，曲线范围内线性良好，检出限低，准确度和精密度高，克服了基质效应的影响，适用于测定羽毛粉中金刚烷胺含量。