羽毛粉是一种将家禽的羽毛水解、干燥、粉碎而获得的高蛋白饲料原料[1]。羽毛粉的蛋白质含量约为77.9%[2],氨基酸含量丰富,尤其是含硫氨基酸含量高于其他饲料原料,且含有维生素、矿物质元素、多肽类[3]以及一些未知的生长因子。羽毛粉可以替代部分蛋白饲料在动物生产中应用,对动物生产性能具有积极影响[4-7]。我国年产生羽毛100万t[8],开发和生产饲用羽毛粉可缓解我国蛋白饲料匮乏的现状。研究表明,毛细血管中药物浓度可直接影响动物毛发中的药物浓度[9-10]。动物吸收的药物通过血液扩散至毛发细胞,在毛发细胞角质化的同时,药物与毛发中的蛋白质紧密结合被长期保存。金刚烷胺是禁用药,对人体健康与环境安全均可产生不良影响[11],但也是鸡类养殖过程中主要的抗病毒药物[12]。被金刚烷胺污染的羽毛所生产的羽毛粉将影响饲料卫生安全。因此,试验拟建立测定羽毛粉中金刚烷胺的方法,为羽毛粉中金刚烷胺的检测提供参考。1材料与方法1.1试剂与材料甲醇(色谱级,Merck公司)、乙腈(色谱级,Merck公司)、甲酸(迪马科技)、甲醇中金刚烷胺标准储备液(100 mg/L,天津阿尔塔科技有限公司)、甲醇中金刚烷胺-D15标准储备液(100 mg/L,天津阿尔塔科技有限公司)、Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL,Waters公司)、Oasis MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL,Waters公司)、PTFE滤膜(上海安普实验科技股份有限公司)。0.2 mol/L盐酸溶液:准确量取18.2 mL盐酸,纯水稀释并定容至1 000 mL。0.1%甲酸溶液:准确量取1 mL甲酸,纯水稀释并定容至1 000 mL。10%甲醇溶液:准确量取10 mL甲醇,纯水稀释并定容至100 mL。准确量取1 mL甲醇中金刚烷胺标准储备液,甲醇稀释并定容至100 mL,得到浓度为1.0 mg/L的外标中间液,准确量取外标中间液1 mL,用甲醇稀释并定容至10 mL,得到浓度为100 μg/L的外标使用液。准确量取1 mL甲醇中金刚烷胺-D15标准储备液,甲醇稀释并定容至100 mL,得到浓度为1.0 mg/L的内标中间液。准确量取内标中间液1 mL,甲醇定容至10 mL,得到浓度为100 μg/L的内标使用液。准确量取适量外标使用液和内标使用液,用10%甲醇溶液配制标准工作液,外标质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L,内标质量浓度为10 μg/L。1.2仪器设备UPLC-Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱仪(Waters公司)、TGL-20M高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)、Multi Reax多点涡旋振荡器(Heidolph公司)、SB-5200DT超声波发生器(宁波新芝生物科技股份有限公司)、SPT-H氮空吹扫仪(北京斯珀特科技有限公司)、VM12固相萃取装置(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。1.3测定指标及方法1.3.1样品制备取羽毛粉样品,混匀,粉碎,密封。准确称取羽毛粉样品0.50 g到50 mL离心管,加入内标使用液0.1 mL,加入5 mL 0.2 mol/L盐酸溶液,混匀,65 ℃恒温水浴锅中保持2 h,取出。加入10 mL乙腈,涡旋1 min,超声提取10 min,加入氯化钠5 g,涡漩1 min,10 000 r/min离心10 min得上清液,上清液过PRiME HLB固相萃取柱,滤液于60 ℃吹干,准确量取10%甲醇溶液1 mL,溶解残渣,混匀,0.22 μm滤膜过滤,仪器测定。1.3.2仪器条件1.3.2.1超高效液相色谱条件色谱柱:Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm);柱温40 ℃;进样体积1 μL;流动相A:0.1%甲酸溶液,流动相B:甲醇。流动相洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.T001表1流动相洗脱程序时间/min流动相体积分数/%流速/(mL/min)A 0.1%甲酸溶液B甲醇09550.32.09550.34.040600.35.040600.35.59550.37.09550.31.3.2.2质谱条件电喷雾离子源:ESI+;检测方式:MRM;电喷雾电压:3.5 kV;雾化气温度:400 ℃;驻留时间:0.106 s。化合物保留时间及质谱参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.T002表2化合物保留时间及质谱参数化合物保留时间/min母离子子离子锥孔电压/V碰撞能/V金刚烷胺4.46152.00135.10302693.103026金刚烷胺-D154.43167.00150.2014282结果与分析2.1仪器条件优化结果金刚烷胺和金刚烷胺-D15分子中带有氨基基团,质谱检测时,该化合物容易得到H+,带正电荷[13],故质谱扫描过程中监测ESI正离子。将0.5 mg/L的金刚烷胺和金刚烷胺-D15注射到质谱内,优化得到待测化合物的子离子及相应的质谱条件。选m/z 135.10和m/z 93.10作为金刚烷胺的子离子,与GB 31660.5—2019[14]中选择的子离子相同。子离子中信号更强、更稳定的m/z 135.10作为定量离子,m/z 93.10作为定性离子。质谱的精确度和灵敏度与驻留时间相关[15]。试验设定驻留时间为0.106 s时,此时金刚烷胺具有良好的峰形。超高效液相色谱使用通用型BEH C18色谱柱,流动相中添加甲酸,保证金刚烷胺具有良好的保留重现性[16],且采用梯度洗脱使金刚烷胺在质谱中得到良好的响应值。金刚烷胺出峰后,采用大比例有机相冲洗色谱柱,避免羽毛粉中的大分子蛋白累积在色谱柱中,导致色谱柱分离效果下降。试验设定色谱柱的柱温为40 ℃,避免环境温度的变化影响待测化合物的保留时间。设定进样体积为1 μL,随着进样量的增加色谱峰的峰形越来越差,导致样品中金刚烷胺的保留时间与标准溶液中的保留时间略有不符。金刚烷胺标准溶液(10 μg/L)、空白样品和阳性添加试样(10 μg/kg)的超高效液相色谱-串联质谱的图谱见图1~图3。图1金刚烷胺标准溶液特征离子图谱(10 μg/L)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F1a1(a)子离子(152135.1)图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F1a2(b)子离子(15293.1)图2空白样品特征离子图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F2a1(a)子离子(152135.1)图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F2a2(b)子离子(15293.1)图谱图3阳性添加样品特征离子图谱(10 μg/kg)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F3a1(a)子离子(152135.1)图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F3a2(b)子离子(15293.1)图谱2.2样品预处理条件优化结果2.2.1水解条件选择金刚烷胺被羽毛粉中蛋白质紧密包裹,应先水解破坏羽毛的结构,将金刚烷胺转变成游离态。酸水解法、碱水解法和酶水解法是检测方法中常见的水解方法[17-19],其中酶水解法可得到游离态化合物最有效的方法,但酶解条件要求严格、成本高。碱水解法药物释放完全,但提取过程需要调节pH值。使用0.2 mol/L盐酸溶液水解羽毛粉条件简单,用时短,不影响后续的提取过程。2.2.2提取条件的选择试验比较了甲醇、乙腈两种常用的提取试剂,结果显示使用乙腈提取液比甲醇更干净,原因是乙腈具有更强的沉淀蛋白的效果[20],且甲醇提取液吹干耗时长[21]。向乙腈中加入乙酸或与2%的三氯乙酸配合使用,未提高金刚烷胺的回收率。因此,试验选用纯乙腈作为提取试剂。提取液中加入无水硫酸钠,实现盐析作用,离心得到更加干净的上清液,为后续的过柱和吹干提供便利。2.2.3净化条件的选择使用MCX固相萃取柱净化金刚烷胺效果理想[22-24]。本试验将PRiME HLB固相萃取柱的净化效果与MCX固相萃取柱进行比较。使用MCX固相萃取柱时,将提取液在60 ℃下氮气吹干,用3 mL 2%的甲酸溶液溶解残渣待净化。依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取柱,待净化液过柱,依次用3 mL 2%的甲酸溶液和3 mL甲醇淋洗,抽干固相萃取柱,洗脱液是6 mL的 5% 氨水甲醇溶液,收集的洗脱液60 ℃吹干,准确量取10%甲醇溶液1 mL,溶解残渣并混匀,0.22 μm滤膜过滤,仪器测定,MCX固相萃取柱净化液中特征离子图谱图4。图4MCX固相萃取柱净化液中特征离子图谱(10 μg/kg)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F4a1(a)子离子(152135.1)图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F4a2(b)子离子(15293.1)图谱由图4可知,使用PRiME HLB固相萃取柱净化时定量离子(m/z 135.10)的响应值更强,且净化效果更好。该固相萃取柱使用了改进的筛板[25],提取液通过顺利,用时少。2.3方法学验证结果2.3.1线性范围与检出限金刚烷胺标准工作液的浓度范围为0.5~50.0 μg/L,采用内标法,将金刚烷胺的浓度作为横坐标,将金刚烷胺定量离子(m/z 135.10)的峰面积与内标金刚烷胺-D15子离子(m/z 150.20)的峰面积之比作为纵坐标,绘制标准曲线:y=0.315 96x+0.008 52。检验方法标准曲线见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.F005图5检验方法标准曲线由图5可知,该曲线的相关系数为0.999 7,线性良好。在空白羽毛粉中逐级减少加入金刚烷胺的水平,样品经水解、提取、净化和浓缩,进行定量分析,方法的定量限和检出限通过色谱峰的信噪比确定[26],大于10倍信噪比作为定量限,定量限为2 μg/kg,大于3倍信噪比时作为检出限,检出限为1 μg/kg。2.3.2准确度与精密度结果在空白羽毛粉中添加金刚烷胺,添加水平分别为2.0、5.0和10.0 μg/kg,参照试验方法进行处理和测试,每个水平重复测试3次,羽毛粉中金刚烷胺的回收率和精密度见表3。由表3可知,方法平均回收率为98.9%~107.2%,相对标准偏差为3.23%~4.67%,本方法准确度和精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.024.T003表3羽毛粉中金刚烷胺的回收率和精密度添加浓度/(μg/kg)测定值/(μg/kg)回收率/%平均回收率/%精密度/%2.02.24112.0107.24.672.04102.02.15107.55.05.07101.4100.73.235.18103.64.8697.210.09.7797.798.93.3510.26102.69.6396.32.4基质效应结果样品前处理得到的待测溶液中仍然存在杂质,使用空白基质和10%甲醇溶液分别稀释,配制标准工作液,计算二者的斜率以检测基质效应[27]。结果显示:空白羽毛粉待测溶液对金刚烷胺存在一定程度的基质抑制效应。为使检测结果更加可靠,试验采用内标法定量,使用金刚烷胺-D15作为内标化合物。使用内标校正后,基质曲线与校准曲线斜率比值为85%~110%,满足方法要求[28]。3结论本试验建立了羽毛粉中金刚烷胺含量的检测方法,该方法耗时短,操作简单,曲线范围内线性良好,检出限低,准确度和精密度高,克服了基质效应的影响,适用于测定羽毛粉中金刚烷胺含量。
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