地西泮属于苯二氮卓镇静剂，又名安定。安眠酮属于喹唑酮类衍生物，又名甲苯喹啉铜，二者均具有镇静催眠、促生长作用，人体使用过量会导致乏力、头晕恶心，个别患者严重时出现短暂的精神失常，长期使用会造成人体大脑神经系统损害，并产生药物依赖[1-3]。在水产品养殖和运输过程中，饵料中添加地西泮和安眠酮能够保持水产品活性，降低鱼类机体代谢，进而增肥增重[4]。为严格控制安眠酮和地西泮非法使用，我国农业农村部176号公告规定了饲料中不得添加安眠酮和地西泮等镇静剂药物，农业农村部在235号公告中规定安眠酮和地西泮为禁止使用药物，在动物源性食品中不得检出。关于安眠酮和地西泮的研究多集中在猪肉、水产品、人体血浆、头发等基质中，对饲料中地西泮含量测定的研究较少[5-6]，鲜有同时检测饲料中安眠酮和地西泮的研究。高效液相色谱法[7-10]、气相色谱-串联质谱法[11-14]、液相色谱-串联质谱法[2,15-19]是测定地西泮和安眠酮的主要方法，但仍缺少对渔用饲料中地西泮和安眠酮同时检测的方法，在实际检测过程中需要使用2种分析方法方可完成对2个化合物的检测。由于饲料基质成分复杂，干扰物较多，而液相色谱-串联质谱法在排除基质干扰、定性和定量准确上具有优势，因此本试验旨在建立一种快速、简单、同时测定渔用饲料中地西泮和安眠酮的方法，为地西泮和安眠酮的同时检测提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂Sciex Triple Quad 5500+超高效液相色谱串联质谱仪（SCIEX公司）、高速冷冻离心机（Sigma公司）、漩涡混匀仪（IKA公司）、超声波清洗器（昆山超声波仪器厂）、24孔氮吹仪（organomation公司）、旋转蒸发仪（Buchi公司）、精密电子天平（梅特勒—托利多称重设备系统有限公司）。地西泮与氘代地西泮DAP-D5标准品（100 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司）、安眠酮标准品（1.0 μg/L，Sigma公司）、氘代安眠酮MEQ-D7（100 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司）、混合阳离子交换固相萃取柱（MCX，150 mg/6 mL，Waters公司）。1.2测定指标及方法1.2.1标准溶液配制分别准确移取地西泮和安眠酮标准品0.50、0.05 mL至50 mL棕色容量瓶，采用甲醇稀释定容至刻度，配制成1.0 mg/L的地西泮与安眠酮混合标准中间液。移取氘代地西泮DAP-D5与氘代安眠酮MEQ-D7标准品，使用甲醇逐级稀释配制成50 μg/L的混合内标溶液。1.2.2样品前处理准确称取粉碎的饲料样品2.0 g（精确至0.01 g）至50 mL离心管，加入0.1 mL混合内标溶液、20 mL乙腈和6 mL 1%三氯乙酸，旋涡混匀，超声提取10 min，取出后8 000 r/min离心5min，上清液置于旋转蒸发瓶。重复操作一次，合并两次提取液于45 ℃水浴中旋转蒸发至干，加入5 mL 0.01 mol/L的盐酸水溶液溶解残渣。取混合阳离子交换固相萃取柱，使用前依次使用3 mL甲醇、3 mL水活化保持柱体湿润。将溶解液加入活化后的MCX柱上，不抽真空保持自然重力下流出，使用8 mL 1%甲酸水淋洗，抽干使用5 mL氨化甲醇（V氨水∶V甲醇=5∶95）洗脱，收集全部洗脱液，45 ℃水浴中氮吹至干。准确加入1 mL乙腈-水（3∶7）定容混匀，过0.22 μm滤膜，上机测定。1.2.3标准曲线绘制吸取适量混合标准中间液（1.0 mg/L），采用经1.2.2处理复溶的空白基质溶液稀释，制得浓度为0.2、0.5、2.0、10.0、25.0、100.0 μg/L基质标准工作溶液。采用液相色谱-三重四极杆质谱联用仪测定，以浓度为横坐标（X），特征离子质量色谱峰与内标物峰面积比为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到标准回归线性方程和相关系数。1.2.4方法回收率与精密度在市场中购买3种不同品牌的渔用饲料，采取标准添加的方法在空白样品中加入低、中、高3个浓度水平混合标准溶液，3个添加水平均做6个平行，并做试剂空白和样品空白试验，按1.2.2进行加标回收率试验，计算加标回收率和相对标准偏差。1.2.5仪器条件1.2.5.1色谱条件色谱柱为phenomenex kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱温为40 ℃，进样量为5 μL，流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为甲醇。采用液相梯度洗脱程序为：0~0.5 min, 10% B；0.5~4.0 min，10%~95% B；4~6 min，95%B；6.1 min，10% B；6.1~8.5 min，10%B。流速为300 μL/min。1.2.5.2质谱条件采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，扫描方式为多反应监测模式（MRM），喷雾电压为ESI+（5 000 V），离子源温度（TEM）为450 ℃，气帘气（cuitain gas）压力为241 kPa，碰撞气（collision gas）压力为62 kPa，喷雾气压力（gas 1）为345 kPa，辅助加热气（gas 2）压力为379 kPa。4种目标物的MRM采集参数见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.T001表14种目标物的MRM采集参数目标物母离子m/z子离子m/z碰撞能量/eV去簇电压/V地西泮285.2193.1*，154.144，40100安眠酮251.1132.1*，91.239，50110氘代地西泮290.1154.140100氘代安眠酮258.1139.038110注：“*”为定量离子。1.2.6样品前处理条件优化称取3份2.0 g（精确至0.01g）空白饲料样品，加入相同质量浓度的地西泮和安眠酮标准溶液，按照1.2.2步骤进行检测，以外标法比较目标物的回收率，分别对提取条件和净化条件进行优化。1.2.7基质效应评价参考文献[20]评价西泮和安眠酮的基质效应。基质效应（ME）=(A/B-1)×100%(1)式中：A为基质匹配标准溶液曲线斜率，B为质量浓度溶剂标液曲线斜率。2结果与分析2.1不同SPE柱对地西泮和安眠酮回收率的影响（见图1）由图1可知，采用MCX固相萃取柱时净化效果最好，回收率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.F001图1不同SPE柱对地西泮和安眠酮回收率的影响2.2添加10.0 μg/kg地西泮和安眠酮的MRM色谱图（见图2）由图2可知，当采用乙腈-水体系时，乙腈的洗脱能力强，化合物保留时间缩短，安眠酮出峰较快，在1~2 min内出峰，出峰太早易受基质干扰的影响。当采用甲醇-水作为流动相，出峰时间有所延后，且峰形比较尖锐，分离度比较高。考虑地西泮和安眠酮采用的正离子模式，在水中加入0.1%甲酸，提高各化合物的离子响应强度。因此，选择甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相，选用0.3 mL/min流速和梯度洗脱程序，可获得较好的洗脱效果和分离度。图2添加10.0 μg/kg地西泮和安眠酮的MRM色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.F2a1（a）安眠酮10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.F2a2（b）氘代安眠酮10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.F2a3（c）地西泮10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.F2a4（d）氘代地西泮2.3基质效应的评价结果当地西泮和安眠酮浓度均为50 μg/L时，计算得出地西泮ME=-47.4%，安眠酮ME=-37.5%。表明饲料基质对两者均具有明显的基质抑制效应。为降低ME的影响，采用同位素稀释法与基质标准曲线相结合的方法减少ME。2.4线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限结果（见表2）由表2可知，采用在空白饲料中添加低浓度目标物标准溶液的方法，以信噪比（S/N）=3和S/N=10分别确定各目标物的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.T002表2线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限结果项目线性方程相关系数线性范围/(μg/L)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)地西泮Y=0.307 88X-0.010 5370.998 60.1~100.00.40.8安眠酮Y=0.329 01X-0.038 8550.999 10.1~100.00.10.22.5地西泮和安眠酮在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差（见表3）由表3可知，在3个添加水平下，地西泮的回收率为79.4%~102.1%，相对标准偏差为4.22%~11.2%；安眠酮的回收率为74.1%~110.4%，相对标准偏差为2.08%~9.09%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2022.19.023.T003表3地西泮和安眠酮在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差（n=6）项目添加水平/(μg/kg)平均回收率/%相对标准偏差/%饲料1饲料2饲料3饲料1饲料2饲料3地西泮1.083.679.480.38.325.068.892.084.285.792.64.227.169.3350.088.5102.193.86.3711.25.26安眠酮0.292.586.674.17.455.279.091.093.887.992.13.187.026.6620.0110.493.592.84.893.762.08本方法回收率和精密度满足分析方法要求，重现性好，适合渔用饲料中地西泮和安眠酮残留的测定。2.6实际样品测定结果采用本研究建立的方法分析测定不同品牌饲料15批次，发现有3份饲料中检出地西泮，含量为1.69~3.72 μg/kg，检出率为20%。3讨论为使地西泮和安眠酮的提取效果达到最高，试验选取兽药残留常用的3种提取溶剂乙腈、甲醇、乙酸乙酯进行对比，发现乙酸乙酯的回收率范围为73.2%~84.5%，甲醇的回收率为79.6%~82.4%，乙腈的回收率为83.3%~92.7%。由于渔用饲料基质复杂，含有蛋白质、碳水化合物、脂肪以及色素等较多的杂质，提取液含有大量脂肪、色素等大分子杂质，提取液较浑浊。韩道财等[19]采用不同浓度的三氯乙酸沉淀鱼肉中的蛋白取得良好的效果，加入1%三氯乙酸达到沉淀脂肪、蛋白质等大分子杂质的目的，在满足提取效率的同时减少杂质的干扰。因此，本试验选择乙腈和1%三氯乙酸作为提取剂。饲料中兽药残留检测常用的净化方式有正己烷净化、固相萃取净化以及QuEChERS法净化3种方法，本文选取相同的待净化溶液比较3种常用的净化方式。于慧娟等[20]采用正己烷对水产品中安眠酮进行提取，采用正己烷净化时，因正己烷对安眠酮有一定的溶解性，会造成安眠酮的结果偏低，影响目标物的回收率。采用QuEChERS法净化时，安眠酮和地西泮的回收率均符合要求，但由于饲料基质复杂，需要添加大量的净化填料，成本过高。因此，本文采用固相萃取的方式对饲料样品的提取液进行净化，比较中性氧化铝柱（Alumina-N）、HLB柱、C18柱和混合阳离子交换柱（MCX）对渔用饲料中地西泮和安眠酮的净化效果和回收率。地西泮和安眠酮均为激素类药物，多为碱性弱极性的化合物[21]。为提高分离速度和目标物灵敏度，色谱柱的选择尤为重要。本试验比较了Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Kinetex C8（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）、Luna Omega（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）共3种规格色谱柱。采用Luna Omega（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）色谱柱时，安眠酮和地西泮出峰较早，在1 min左右均全部出峰，原因可能是该款色谱柱固定相中含有酰胺多元醇，带接头的氨基和极性封端，在高含量的乙腈条件下，弱极性化合物在运行早期即被迫洗脱，更适合强极性目标物的分离。当采用Kinetex C8色谱柱时，目标物色谱峰分离比较远，峰形不对称有拖尾现象。当采用Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）时，柱效更高，目标物的峰形尖锐且与基线分离，拥有更好的分离度和灵敏度。本文采用同位素稀释法进行定量，选用DAP-D5和MEQ-D7分别作为地西泮和安眠酮的内标物。将浓度为50 μg/L的4种目标物混合标准溶液以针泵进样方式进入质谱仪，采用正离子模式在m/z 150~500范围内进行一级质谱全扫描，确定地西泮、安眠酮、DAP-D5和MEQ-D7准分子离子[M+H]+，优化离子源参数，使质谱灵敏度达到最佳状态。在正离子模式下，通过对碰撞能量、去簇电压等质谱参数进行优化，在二级质谱扫描模式下，选取离子丰度强、选择干扰小的子离子作为定量离子，次强的子离子作为定性离子，满足药物分析确诊的要求，最终确定质谱条件。液相色谱串联质谱法采用电喷雾电源（ESI）模式时，样品中的杂质影响目标物的离子化，表现出抑制或增强目标物的离子响应，即基质效应（ME）。而ME普遍存在于生物样品的LC-MS定量分析中，采取有效措施减少其影响对结果定量的准确性非常有必要。本文采用同位素稀释法能够有效地消除基质效应的影响，还可减少样品前处理过程中人为引入的误差，提高方法的准确性和重现性。4结论本方法采用固相萃取方式，建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定渔用饲料中地西泮和安眠酮残留的检测方法。样品采用乙腈提取，MCX固相萃取柱净化，缩短了前处理时间；采用同位素稀释添加和基质标曲相结合的方式抑制基质效应对结果定量的影响，提高了方法的准确性和重复性。该方法可全面准确的监测饲料中地西泮和安眠酮残留，对渔用饲料进行有效监控。