手性是表述化合物的分子结构具有不对称性的术语，是自然界的本质属性之一。手性化合物在三维结构中不能完全重叠，彼此是实物和镜像的关系，这种互为镜像关系的立体异构体称为对映异构体（对映体）[1]。手性药物是具有手性因素的药物分子，也是具有药理活性的手性化合物，只含有效对映体或以有效对映体为主[2-6]。检测这类药物的代谢残留时应充分考虑其手性问题，通常要采用适应的拆分方法分离其对映体，如氟苯尼考、克伦特罗、四氢呋喃-2-甲酸甲酯均有相应的对映体[7-10]。目前，兽药临床常用的药物中，部分药物的对映体药理活性和毒副作用具有显著差异。如左旋咪唑是一种广谱的杀虫药物，其左旋体具有较强的杀虫效果，而其右旋体则是不良反应的来源[3]。手性药物的异构体之间存在立体结构的差异，导致其与活性分子间出现不同的相互作用，产生异构体间药理活性、代谢过程、毒性等差异。建立快速、准确、高效的手性药物拆分方法对于新药开发、药物的质量控制、对映体生理活性、监测对映体立体选择性等研究具有重要意义。在众多方法中，手性固定相法具有通用性、灵活性、要求低、操作简便等优点。在手性药物拆分过程中，所分离的对映体不会发生构型和性质的变化且原有的生物活性能够得到很好的保存[11-12]。因此，手性固定相法成为手性药物分离领域的研究热点与核心。文章对兽药手性色谱分离方法中常见的固定相，如多糖类手性固定相、大环抗生素类手性固定相、分子印迹手性固定相、配体交换手性固定相等[13-19]进行系统梳理，以期为实践工作中选择适宜的手性分离固定相提供参考。1手性兽药对映体的拆分方法手性兽药对映体拆分，是指在不对称的环境中，利用对映体物理和化学性质的差异，使对映异构体分离得到有光学活性的单一产物。手性对映体拆分法可分为非色谱法和色谱法，其中色谱分离技术具有成本低、回收率高、适用范围广等优势，在对映体的分离与测定方面具有较大的优越性，是医药领域中主要的手性分离手段[20]。目前，手性分离方法绝大多数为具有高效、高速、高灵敏度的特点的高效液相色谱法（HPLC）。在使用HPLC法进行手性兽药拆分时，通常为直接法（手性固定相法或流动相添加剂法）和间接法（衍生化法）。其共同特点是以HPLC技术为基础，引入连有4个不同基团的手性中心。不同之处则是直接法将手性中心引入分子间而不改变原有的分子结构，间接法则是通过引入分子内从而改变原有的分子结构实现对药物的分离，使对映异构体之间产生物理差异。2常见兽药手性色谱分离的固定相2.1多糖衍生物类手性色谱固定相目前，多糖类手性固定相主要是纤维素及其衍生物CSP[16]，因其具有较为强大的手性拆分能力，在液相色谱直接拆分手性对映体方面应用愈发广泛[21-25]。如纤维素由D-葡萄糖单元构成，其手性选择性较差，经过衍生后可增加手性识别能力，如3,5-二甲苯基氨基甲酸酯、4-甲基苯甲酸酯等。淀粉衍生物方面，徐红月等[26]改造的淀粉-2-苯甲酸酯-3-（3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯）-6-（（S）-1-苯基乙基氨基甲酸酯）具有较好的手性识别能力，将此新型材料涂布于氨丙基硅胶上，在正相高效液相色谱分离中具有较好的手性识别效果。2.2大环抗生素类手性色谱固定相大环抗生素相对分子质量一般在500~3 000之间，分子结构中含有手性中心，并具有立体的环状结构和多个活性基团，其中糖肽型化合物也具有空穴结构。这些活性基团可以与手性分子发生多种相互作用，使其具有较高的手性识别能力以及高稳定性等优点。大环抗生素类手性固定较为耐用，可用于含水和非水流动相，对溶剂或添加剂无记忆效应，特别适用于中性、极性和电离化合物的分离，在手性化合物的拆分方面已被较好应用。张丹丹等[27]利用万古霉素、替考拉宁和利托菌素等3种大环抗生素类手性色谱固定相，通过HPLC拆分盐酸马布特罗对映体，结果表明，Chirobiotic V、T固定相较盐酸马布特罗对映体分离效果更佳，而Chirobiotic R结构中缺少与盐酸马布特罗对映体的结合位点，不适用于盐酸马布特罗对映体的手性分离。2.3分子印迹聚合物手性色谱固定相分子印迹聚合物手性色谱固定相的拆分原理是分子之间的相互作用，通过交联剂聚合，再经过洗脱获得的纯度较高的聚合物[28-30]。分子印迹聚合物技术具有对目标分子选择识别能力强、高回收率、无污染等优点，广泛应用于医药和食品等领域。不同领域的分子印迹聚合物种类不同，如双分子印迹聚合物、磁性分子印迹聚合物等。在分离手性化合物的过程中，将分子印迹聚合物作为色谱填料，不仅操作简单、快速、高效，而且利用其表面印迹空穴中多具有的特异性识别位点，兼其所具生物识别体系的优点，可选择性识别富集复杂样品中的目标物，从而实现手性分子的拆分[31]。与普通的手性固定相相比，将一种对映体作为模板分子制备的手性印迹聚合物，由于其保留性很强，故将其作为固定相拆分手性化合物，从而分离对映体[32]。这种技术已广泛应用于固相萃取、固相微萃取、手性拆分、抗体模拟等方面，并实现痕量样品的快速检测[33]。3配体交换手性色谱固定相配体交换手性色谱固定相的手性识别过程中，在形成离子络合物的空间中形成络合键的同时，手性固定相与被拆分的分子发生内部相互作用，这种作用通过金属络合物的络合空间完成，可有效拆分氨基酸及羟基酸等对映体[34]。宋瑞娟等[35]通过引入苯乙烯长链，在巯丙基硅胶表面，加入甲基丙烯酸缩水甘油酯，并在聚苯乙烯链端进行延长，后用L-脯氨酸和L-羟脯氨酸进行修饰的方法，合成两种聚合物型配体交换型手性固定相（CSP Ⅳ和CSP Ⅴ），并采用6种氨基酸对映体考察合成固定相的色谱拆分效果。结果表明，除DL-脯氨酸外，其余氨基酸对映体均具有相同的出峰顺序，即D-异构体优先出峰。与不含聚苯乙烯单元的配体交换型手性固定相相比，CSP Ⅳ和CSP Ⅴ具有较小的保留因子、较好的对映体选择性和较高的分离度。4分子印迹冰胶聚合物手性色谱固定相分子印迹冰胶聚合物手性色谱固定相，通常由冰胶制备成颗粒包埋型分子印迹冰胶聚合物构成。冰胶具有大孔状结构。有研究将分子印迹的特异识别性与冰胶的多孔结构和高通量结合，研制分子印迹冰胶聚合物手性色谱固定相。结果显示，与其他分子印迹聚合物相比，该类手性色谱固定相具有大孔、介孔和微孔3种孔径结构，进而可以实现快速的对流传质。分子印记冰胶聚合物对于蛋白质拥有更高的柱效以及色谱亲和能力，因而可以广泛应用于血清、尿液、细胞破裂上清液等生物样品中的手性识别和生物分离等[36]。5展望随着手性拆分技术的逐渐成熟，人们对手性化合物的认识愈加清晰，对其对映体的生物活性作用机制的研究正逐步深入。文章梳理不同种类的手性色谱固定相，了解手性拆分技术研究发展历程，阐述不同类型的手性固定相的优势以及手性兽药拆分的意义。随着多学科的交叉融合，人们已将色谱分析技术与计算机模拟技术相结合，模拟药物分离过程，促进拆分分离技术的发展。此外，多样化的拆分技术也频见报道，如酶法、膜反应法等。同时，新型手性拆分材料，如手性CMS纳米粒子等，将扩充手性拆分的范围。目前应用于实际生产的分离方法各有特点，提高分离效率并实现环保将是今后研究的主要方向，手性分离技术研究将成为药物研究领域的热点。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.022.F001