禽流感（avian influenza，AI）是由正黏病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类传染病。根据病毒的毒力不同，分为高致病性和低致病性禽流感[1]。低致病性禽流感（LPAI）能感染禽类，各种日龄的家禽都可发生感染[2]，常能引起鸡的炎性损伤[3]。低致病性H9N2 AIV能感染人和多种哺乳动物[4]，并引起一定程度的炎性损伤[5]。白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在机体的炎症反应和免疫反应起着重要作用。有研究发现，炎症性肠病患者血清TNF-α、IL-2水平表达上升[6]。IL-2主要由CD4+细胞、CD8+细胞和NK细胞产生，对机体细胞免疫和体液免疫均有良好的促进和提升作用，而TNF-α作为重要的炎症细胞因子，对免疫具有调节作用。史丹丹等[7]研究表明，钙调蛋白（calmodulin，CaM）能参与介导急性骨骼肌炎症反应。CaM可能通过调节细胞内Ca2+的浓度，或者直接参与介导炎症和免疫反应。AIV感染不同种类动物，引起的症状不同，可能跟机体的免疫反应和炎性反应有关。试验通过观察鸡、鸭和小鼠外周血中IL-2和TNF-α以及肺组织中CaM的转录和表达情况，了解低致病性H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠造成炎性损伤的情况，以期为低致病性禽流感对不同种类动物致病机制提供参考。1材料与方法1.1试验动物24只52日龄黑羽乌骨鸡和24只52日龄樱桃谷肉鸭购自贵阳绿源禽业有限公司。24只6~8周龄昆明系小鼠购自贵阳医学院。1.2病毒鸡源H9N2 AIV，EID50=10-7.62，由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存并馈赠。1.3试验试剂鸡、鸭和小鼠IL-2、TNF-α、CaM ELISA试剂盒均购自科诺迪生物有限公司；M-MLV反转录酶、TaqDNA聚合酶、SYBR Premix Ex Tap Ⅱ均购自TaKaRa公司。1.4试验动物分组及处理按动物种类将24只鸡、24只鸭和24只小鼠随机分成4组，0、3、6、9 d作为分组标记。0 d作为阴性组，静脉注射0.2 mL PBS，12 h后采集其外周血和肺组织，3、6、9 d作为阳性组，参考文献静脉注射0.2 mL H9N2 AIV[8]，在感染AIV 3、6、9 d后分别采集其外周血和肺组织。1.5测定指标及方法1.5.1IL-2、TNF-α含量按照鸡、鸭和小鼠IL-2、TNF-α ELISA试剂盒说明书进行检测。1.5.2CaM mRNA水平参照GenBank中相关序列和参考文献设计鸡、鸭和小鼠β-actin内参基因及CaM基因引物，见表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用Trizol法提取各组肺组织中的总RNA，转化为cDNA后进行荧光RT-PCR扩增。扩增体系：SYBR Premix Ex Tap Ⅱ5 μL、模板1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 3 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；55 ℃退火、延伸30 s，每个循环结束时进行荧光信号检测，共40个循环，反应结束后温度降到65 ℃，再以0.5 ℃、20 s升温至95 ℃并检测荧光信号得到熔解曲线。经荧光检测后得到相应的CT值，根据2-ΔΔCt法计算各组动物CaM的相对表达量。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.001.T001表1鸡、鸭和小鼠β-actin内参基因及CaM基因引物Tab.1The β-actin gene and CaM gene primers in chicken, duck and mice引物名称引物序列（5'→3'）产物大小/bp退火温度/℃鸡β-actinF：ATTTCTCTCTCGGCTGTGGTG13957R：CTGTGCCCATCTATGAAGGCTA鸭β-actinF：CTACAGCTTCACCACCACAGCC9858R：CTGTGGCCATCTCCTGCTCGAA小鼠β-actinF：GAGCAATGATCTTGATCTTC20350R：TTCCTTCTTGGGTATGGAAT鸡CaMF：TGGAGTTGGTAAAATGAGGGAA16656R：ACGCACTGGAAAACTAGGGTCA鸭CaMF：AAGACTCGGAATGCCTCA18954R：AAAAGAACTGGGAACTGT小鼠CaMF：TCG CCATCAATATCTGCTTC11157R：GAATGGTTACATCAGTGCGG1.5.3CaM含量将鸡、鸭和小鼠肺组织加等量的PBS研磨后，取上清液-20 ℃冷冻保存，按照CaM ELISA试剂盒说明书进行操作，计算各组动物肺组织中CaM的含量。1.6数据统计与分析试验所得数据采用SPSS 20软件进行单因素方差分析，应用Duncan's法进行组间数据的多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠血清中IL-2含量的影响（见表2）由表2可知，与0 d（感染前）比，鸡的IL-2浓度在感染H9N2 AIV 3、6、9 d后均显著升高（P0.05）；鸭的IL-2浓度在感染H9N2 AIV 3、9 d后显著升高（P0.05），6 d后极显著升高（P0.01）；小鼠的IL-2浓度在感染H9N2 AIV 3 d后显著升高（P0.05），6 d后极显著升高（P0.01）。在感染H9N2 AIV前后，鸭的IL-2浓度最高，其次是小鼠，最后是鸡。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.001.T002表2H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠血清中IL-2含量的影响Tab.2Effect of H9N2 AIV on the serum IL-2 content of chickens, ducks and mice （n=6）品种0 d3 d6 d9 d鸡213.35±21.25b273.71±42.58a283.78±33.32a288.99±24.74a鸭732.75±189.92Bb1113.06±170.80ABa1352.76±200.45Aa1189.38±307.16ABa小鼠445.42±8.14Bb488.6±45.68ABa526.29±31.58Aa470.85±26.49ABab注 ：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05）；无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。ng/L2.2H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠血清中TNF-α含量的影响（见表3）由表3可知，与0 d（感染前）比，鸡的TNF-α浓度在感染H9N2 AIV 6、9 d后均显著升高（P0.05）；鸭的TNF-α浓度在感染H9N2 AIV 6 d后极显著升高（P0.01），9 d后显著升高（P0.05）；小鼠的TNF-α浓度在感染H9N2 AIV 3、6、9 d后显著升高（P0.05）。在感染H9N2 AIV前后，小鼠的TNF-α浓度最高，其次是鸭，最后是鸡。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.001.T003表3H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠血清中TNF-α含量的影响Tab.3Effect of H9N2 AIV on the serum TNF-α content of chickens, ducks and mice （n=6）品种0 d3 d6 d9 d鸡46.41±6.60b55.51±7.72ab58.22±4.43a60.46±8.81a鸭182.63±24.74Bb240.87±43.63ABab316.92±68.71Aa267.98±42.03ABa小鼠207.06±30.19b253.34±20.04a263.25±43.99a259.94±27.86ang/L2.3H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠肺组织CaM的影响2.3.1H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠肺组织CaM转录的影响（见表4）由表4可知，与0 d（感染前）比，鸡的CaM转录水平在感染H9N2 AIV 3、9 d后显著升高（P0.05），6 d后极显著升高（P0.01）；鸭的CaM转录水平在感染H9N2 AIV 6 d后显著升高（P0.05）；小鼠的CaM转录水平在感染H9N2 AIV 3 d后显著升高（P0.05），6 d后极显著升高（P0.01）。在感染H9N2 AIV 3、6、9 d后鸡的CaM转录水平均高于鸭和小鼠。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.001.T004表4H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠肺组织CaM转录的影响Tab.4Effect of H9N2 AIV on CaM transcription in lung tissues of chickens, ducks and mice （n=6）品种0 d3 d6 d9 d鸡2.48±0.99Bb12.01±0.90ABa36.19±0.77Aa19.12±0.49ABa鸭0.73±0.25b3.94±0.70ab8.87±0.37a1.73±1.56ab小鼠0.99±1.15Bb2.44±1.49ABa7.01±1.51Aa0.88±1.11ABab2.3.2H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠肺组织CaM含量的影响（见表5）由表5可知，与0 d（感染前）比，鸡的CaM含量在感染H9N2 AIV 6 d后极显著降低（P0.01），9 d后显著降低（P0.05）；鸭的CaM含量在感染H9N2 AIV 9 d后极显著降低（P0.01）；小鼠的CaM含量在感染H9N2 AIV 6 d后极显著降低（P0.01）。在感染H9N2 AIV 3、6、9 d后，鸡的CaM含量最高，其次是鸭，最后是小鼠。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.03.001.T005表5H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠肺组织CaM含量的影响Tab.5Effect of H9N2 AIV on the content of CaM in lung tissues of chickens, ducks and mice （n=6）品种0 d3 d6 d9 d鸡59.02±5.44Aa55.63±6.38ABab49.57±3.09Bb52.51±5.26ABb鸭25.32±4.58A22.62±3.72AB21.14±4.97AB19.83±3.07B小鼠10.48±1.31Aa9.36±1.61ABa7.40±0.55Bb10.43±2.04Aaμg/L3讨论3.1H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠IL-2、TNF-α含量的影响研究表明，禽流感感染患者体内血清细胞因子水平显著升高[9]，通常情况下宿主感染AIV后会立即产生大量的细胞因子，随后启动局部或全身的炎症反应[10]。IL-2可以激活巨噬细胞、淋巴细胞等能产生TNF-α、INF-α和NO细胞因子，增强机体免疫应答，参与机体的炎症反应[11]。IL-2对机体免疫反应具有促进作用[12]。研究发现，人工感染H9N2 AIV后第4 d鸡脑组织中IL-2的mRNA含量极显著上调[13]。而TNF-α作为典型的炎症细胞因子，也是最重要的促炎因子，可以直接参与炎症反应[14-15]。TNF-α适量的表达，有助于激活机体的免疫，但过量表达就会造成炎性损伤，甚至会导致细胞凋亡[16]。在试验中，在感染AIV 3 d后鸡、鸭和小鼠IL-2含量均显著升高，6 d时鸭和小鼠的IL-2含量极显著升高，而在感染AIV 6d后鸡和小鼠的TNF-α含量均显著升高，鸭极显著升高，说明在感染AIV后鸡、鸭和小鼠均发生了免疫反应和炎性反应，在6 d时3种动物的免疫和炎性反应最为明显，而3种动物相比，鸭的IL-2和TNF-α变化最明显，小鼠的IL-2变化最明显。大量研究结果表明，鸡与鸭的免疫反应基因结构和表达特征具有显著差异，这些差异可能与它们对AIV抵抗力不同相关[17]。而鸭和小鼠在感染AIV前后，IL-2、TNF-α浓度均较鸡高，可能鸭和小鼠感染AIV无明显症状与细胞因子参与免疫反应有关。3.2H9N2 AIV对鸡、鸭和小鼠CaM mRNA的转录水平及含量的影响CaM在动物机体细胞内能与很多配体相互作用，参与介导炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、记忆活动、神经生长及免疫反应等生命活动[18]，同时CaM可以直接参与动物机体的炎症和炎性反应[19]。Ca2+被称为是细胞内的第二信使，而CaM可通过调节机体内Ca2+浓度来调节细胞的功能[20]。若发生细胞内Ca2+超载、Ca2+分布紊乱，就有可能引起细胞毒性，导致细胞的死亡[21]。在细胞凋亡和自噬过程中，Ca2+引起的依赖信号转导机制涉及不同的CaM调控系统[22]，而自噬过程可以通过Akt-mTOR、MAPK和NF-κB信号等通路参与H9N2 AIV诱导的急性肺损伤[23]。感染AIV后，鸡、鸭和小鼠的CaM的转录水平显著上调，在6 d时达到最大值，这与其炎性反应是一致的。但鸡和小鼠在感染AIV后6 d的CaM表达量却极显著下降，而鸭在感染后9 d CaM表达量极显著下降，CaM可能参与炎性反应的初始阶段，对炎性反应有促进作用，或许是直接参与炎性反应，所以导致CaM的转录水平显著升高。H9N2 AIV感染可抑制鸡的免疫应答，其中对细胞免疫应答的抑制更为明显[24]，所以对CaM的表达有抑制作用，可能通过抑制CaM的表达来减轻机体的免疫反应，但AIV如何影响CaM mRNA的转录和CaM的蛋白表达，其机制还有待进一步探讨。4结论本研究表明，鸭和小鼠外周血IL-2、TNF-α含量在感染前后均比鸡高，而鸭和小鼠肺的炎性损伤也较鸡轻，说明AIV造成的炎性损伤可能与IL-2、TNF-α含量有关。感染AIV后，CaM在3种动物肺组织中的转录水平显著升高，但其在肺组织中的含量下降，说明CaM在AIV造成的肺组织炎性损伤中可能起重要作用，但AIV对CaM的表达有抑制作用，具体机制还需要进一步研究。