传统的中药炮制方法多采用煮、煎、煅、浸、蒸、熬等工艺，易对中药的活性成分造成破坏。近年来，随着中医药学、微生态学发展，机体微生态菌对口服中药吸收利用及其药理作用的影响逐渐明了，微生态菌发酵中药技术应运而生[1-2]。应用具有分解和转化能力的微生态菌发酵中药，可保护中药活性成分，并提高有效成分的提取率[3-4]。某些毒性大的中药经过微生物发酵后可降低其毒副作用，减少不良反应[5]。微生物代谢过程中产生的某些代谢产物能够与药材中的某些成分发生反应，进而产生新的活性物质[6-8]。板蓝根为我国传统中药，性寒，味微甜后苦涩。现代药理学研究表明，板蓝根具有抗内毒素、解热、抗炎、抗病原微生物的作用，兽医临床常用于治疗咽喉肿痛、口舌生疮、疮黄肿毒、风热感冒[9]。（R，S）-告依春（又名表告依春）是板蓝根主要抗病毒成分，（R，S）-告依春含量是反映板蓝根药材质量的重要指标[10]。本试验利用解淀粉芽孢杆菌对板蓝根进行固体发酵，应用高效液相色谱-紫外检测法（high performance liquid chromatography couple with ultraviolet detector，HPLC-UV）对发酵前后（R，S）-告依春含量进行比较分析，为发酵板蓝根制品的质量控制提供数据支持，并为后续生产应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验试剂产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌SSY1株由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院微生物研究室分离鉴定并保存。板蓝根、黄芪饮片（哈尔滨绿达生动物药业），(R，S)-告依春对照品（含量≥98%，标物编号BW1662-20 mg，河南万佳标准物质研发中心），甲醇（色谱纯，北京百灵威科技有限公司）、磷酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。1.1.2试验仪器Labsolution色谱工作站、LC-20AT二元泵、SPD-20A紫外检测器（岛津公司），MS104TS型电子天平（梅特勒-托利多公司）、KQ5200B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）、XYE-2-20H型超纯水仪（北京湘顺源科技有限公司）、GM-0.33A型隔膜真空泵（天津津腾实验设备有限公司）、HZQ-F100型恒温振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、DH4000Ⅱ型电热恒温培养箱（天津泰斯特仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1标准品制备称取（R，S）-告依春标准品4 mg于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成40 mg/L浓度的标准品溶液[11]。1.2.2样品处理以板蓝根粉10%、黄芪粉20%、黄豆粉10%、CaCO3 0.2%、水59.8%的配比，制备板蓝根固态发酵培养基，121 ℃高压灭菌20 min。取活化的解淀粉芽孢杆菌SSYB种子液（3.05×108 CFU/mL），以2%接种量（v/w）接种板蓝根固态发酵培养基，37 ℃恒温培养72 h，即为发酵板蓝根[12]，制得发酵物中活菌数为1.7×1010 CFU/g。取灭菌营养肉汤，以2%接种量（v/w）接种板蓝根固态发酵培养基，37 ℃恒温培养72 h，作为对照品。1.2.3有效成分提取取发酵组与对照组培养物各5 g，置于100 mL蓝盖试剂瓶，加入50 mL超纯水，充分混匀，称重。超声提取45 min，静置至室温，再称重。用超纯水补足减少的重量，充分混匀，13 000 r/min离心6 min，取5 mL上清液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。充分混匀后用0.45 µm尼龙滤膜过滤，超声除气[11,13]。1.2.4检测方法建立1.2.4.1色谱条件Inertsustain C18液相色谱柱（5 µm，150 mm×4.6 mm），流动相：甲醇-0.02%磷酸溶液（7∶93）；流速：1.0 mL/min；检测波长：245 nm；进样量：10 µL[11]。1.2.4.2线性关系考察取1.2.1制备的（R，S）-告依春标准品溶液，加甲醇分别制成5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L的溶液，经0.45 µm尼龙滤膜过滤，超声除气。按1.2.4.1色谱条件测定峰面积，以标准品浓度（X）为横坐标，色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程[13]。1.2.4.3精密度试验自动进样器吸取10 µL浓度为40 mg/L的（R，S）-告依春标准品溶液，在相同条件下重复进样6次。测定（R，S）-告依春峰面积并计算RSD值，以考察方法精密度[13]。1.2.4.4稳定性试验取同一份浓度为40 mg/L的（R，S）-告依春标准品溶液，在放置0、2、4、6、12、24 h后自动进样1次，测定（R，S）-告依春峰面积并计算RSD值，以考察方法稳定性[13]。1.2.4.5重复性试验取同一份发酵板蓝根培养物，按1.2.3操作平行制备6份供试品溶液，每份供试品自动进样1次，测定（R，S）-告依春峰面积并计算RSD值，以考察方法重复性[13]。1.2.4.6回收率试验采用加样回收法进行，精密称取含量已知的发酵板蓝根培养物，加入不同含量的（R，S）-告依春标准品，按1.2.3操作进行处理，按1.2.4.1色谱条件测定峰面积，代入回归方程计算（R，S）-告依春含量，计算回收率，每个添加量设3个重复[13]。1.2.5样品含量测定取发酵组和对照组培养物，按1.2.3操作进行处理，按1.2.4.1色谱条件测定峰面积，代入回归方程计算（R，S）-告依春含量，每个处理品平行测定3次[13]。1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1检测方法建立2.1.1（R，S）-告依春标准曲线（见图1）由图1可知，建立回归方程为Y＝79 466X－225 804，相关系数R2＝0.999 6，线性范围为5~40 mg/L，表明线性关系良好。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.002.F001图1（R，S）-告依春标准曲线Fig.1Standard curve of (R, S)-goitrin2.1.2精密度试验结果自动进样器吸取10 µL浓度为40 mg/L的（R，S）-告依春标准品溶液，在相同条件下重复进样6次，测得峰面积分别为2 952 875、2 951 922、2 940 916、2 883 366、2 908 811、2 908 748，RSD值为0.97%，表明所建立检测方法精密度良好。2.1.3稳定性试验结果取同一份浓度为40 mg/L的（R，S）-告依春标准品溶液，分别在放置0、2、4、6、12、24 h后自动进样1次，测得峰面积分别为2 952 875、2 950 889、2 940 121、2 883 358、2 828 551、2 832 460，RSD值为2.01%，表明供试样品在24 h内稳定。2.1.4重复性试验结果取同一份发酵板蓝根培养物，按1.2.3操作平行制备6份供试品溶液，每份供试品自动进样1次，测得（R，S）-告依春峰面积分别为23 162、23 639、23 083、22 845、23 321、23 004，RSD为1.20%，表明所建立检测方法重复性良好。2.1.5回收率试验结果（见表1）由表1可知，其平均回收率为98.28%，RSD值为1.51%，表明所建立检测方法具有较好的准确度。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.002.T001表1回收率试验结果Tab.1Recovery rate test results编号对照品加入量/mg样品含量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.120.579 20.69899.8398.281.5120.120.579 20.67195.9730.120.579 20.67997.1140.240.579 20.81499.3750.240.579 20.80598.2760.240.579 20.81299.122.2样品含量测定取发酵组和对照组培养物，按“1.3.3”操作进行处理，按“1.3.4.1”色谱条件测定峰面积，代入回归方程计算（R，S）-告依春含量，每个处理品平行测定3次，结果见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.002.T002表2板蓝根固态培养物中（R，S）-告依春含量Tab.2(R, S)-goitrin content in Radix isatidis solid culture组别含量平均含量对照组0.582 60.585 500±0.002 6100.587 60.586 4发酵组0.626 60.626 900±0.000 757*0.627 80.626 4注 ：*表示同列数据差异极显著（P0.01）。mg/g由表2可知，在37 ℃条件下恒温培养72 h后，发酵组（R，S）-告依春含量比对照组极显著提高了7.07%（P0.01）。3讨论中药发酵制品质量控制关键在于中药的有效成分及其含量。（R，S）-告依春为板蓝根的主要抗病毒成分[10,14-16]，故本试验以（R，S）-告依春的含量作为评价指标，能够较好反映解淀粉芽孢杆菌发酵对板蓝根有效成分含量的影响。药典中采用高效液相色谱法测定板蓝根药材中（R，S）-告依春的含量[10]。本试验以超纯水为溶剂，采用超声提取法提取45 min，该方法（R，S）-告依春提取效率相对较高[13]。以甲醇-0.02%磷酸溶液（7∶93）为流动相，检测波长设为245 nm，流速设置1.0 mL/min，进样量为10 µL[11]。在此色谱条件下，检测解淀粉芽孢杆菌发酵组与对照组样品，目标峰分离效果好，适于板蓝根主要有效成分变化分析。结果表明，经解淀粉芽孢杆菌发酵的板蓝根固态培养物中（R，S）-告依春含量较未发酵组提高了7.07%。张文意等[17]采用UPLC-MC对槐耳板蓝根双向发酵成分进行分析，发现发酵体系中特征化合物表告依春含量随着发酵的进行显著增加，与本研究结果一致。微生物具有丰富的酶系统，能够分解、转化物质。中草药经微生物发酵后，其有效成分和活性物质被最大限度释放，同时还可产生新的活性物质[18]，降低毒副作用[19]，增强药效。戴万生等[20]使用酿酒酵母、面包酵母发酵大黄，测得其总蒽醌含量仅略微降低，但其中起泻下作用的结合型蒽醌含量较生大黄降低一半，而起抗菌、抗肿瘤作用的游离型蒽醌含量增加了6倍左右。陈永强等[21]研究表明，微生物代谢产生的β-葡萄糖醛酸酶能够将甘草中的甘草酸转化成甘草次酸，从而被消化系统直接吸收利用，使机体在短时间内达到较高的血药浓度并迅速作用于靶器官，进而发挥甘草的消炎、止痛作用。本试验选用对板蓝根进行固体发酵的解淀粉芽孢杆菌具有产纤维素酶能力[22]，此前也曾用于中药黄芪的固体发酵[23]。有报道指出，纤维素酶可提高板蓝根有效成分的释放[24]，可能是本试验发酵组板蓝根（R，S）-告依春含量增加的原因之一。然而中药所含成分较多，且生物发酵过程易受到发酵菌种、发酵条件及发酵成分等多方面因素的影响，产生的活性物质也有所变化[6]。板蓝根成分复杂，含有多种有效成分，其总生物碱具有抗炎、抗病毒、解热的作用[25]。本试验中导致板蓝根（R，S）-告依春含量增加的原因，究竟是解淀粉芽孢杆菌产生的纤维素酶分解细胞壁释放有效成分，还是由菌种将生物碱转化为（R，S）-告依春，仍需进一步试验加以印证。本试验仅对（R，S）-告依春的含量进行了测定，后续可对其他成分变化进行检测。4结论本研究结果表明，板蓝根经解淀粉芽孢杆菌固态发酵后可使（R，S）-告依春含量显著升高，较未发酵时增加了7.07%。