奶牛乳腺炎频发可影响奶制品的品质，造成了巨大的经济损失，危害人类健康，是奶牛养殖业面临的难题之一[1]。奶牛乳腺炎的主要病原之一即乳房链球菌[2-3]。乳房链球菌在牛口腔、皮肤、乳头、粪便及养殖场周围环境中普遍存在，检出率高达63％[4-5]，其引发的奶牛乳房炎不易治愈，且泌乳量急剧下降[6-7]。陶晓丽[8]在临颍县部分地区73份患有奶牛乳房炎的乳汁样品中分离鉴定到乳房链球菌，分离率高达30.21％。由此可见，乳房链球菌在养殖场环境以及患乳腺炎奶牛的奶汁中均具有较高的检出率。本研究从南京某奶牛场分离鉴定到一株乳房链球菌，通过研究该菌株的病原特性，以期为防治奶牛乳腺炎制订方案及制备相关疫苗提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株来源菌株分离自南京某奶牛养殖场患乳腺炎奶牛的乳汁。1.1.2试剂与仪器奶牛乳腺炎致病菌显色培养基（广州新齐行生物技术有限公司），绵羊血琼脂平板、革兰氏染色试剂盒、TSA培养基、生化鉴定试剂盒（广东环凯微生物科技有限公司），30种抗菌药敏片（杭州微生物试剂有限公司）、酵母提取物和胰蛋白胨（OXOID公司）、氯化钠（广州化学试剂厂）、PCR引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）。恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、恒温培养摇床（上海旻泉有限公司）。1.2试验方法1.2.1乳房链球菌的分离纯化灭菌接种环蘸取奶样在奶牛乳腺炎致病菌显色培养基上划线，置于37 ℃温箱中过夜培养；挑取疑似链球菌的菌落重新划线于绵羊血琼脂平板，置于37 ℃温箱中过夜培养。观察菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察。1.2.2乳房链球菌的PCR鉴定取100 μL含有分离菌株的液体于1.5 mL离心管中，置于100 ℃水中煮沸10 min；取煮沸后的液体作为PCR反应的模板，采用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，引物序列为27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系（50 µL）：上、下游引物各2 µL及r-Taq DNA 聚合酶25 µL、模板4 µL、灭菌去离子水17 µL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测后送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.3乳房链球菌的生化鉴定用灭菌生理盐水将乳房链球菌配制成约108 CFU/mL的菌悬液，用吸管吸取2滴（约0.06 mL）菌悬液加入15支微量生化管内，按说明书要求进行培养，观察结果。1.2.4液体培养基的优化基础配方为10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取液、10 g/L氯化钠；通过调整其中一个组分的浓度设置7种配制方案，配制方案见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.T001表1LB液体培养基配制方案Tab.1LB liquid medium preparation groups编号蛋白胨酵母提取物氯化钠1105102105831051248510512510610410710610g/L将纯培养后的乳房链球菌二级种子液转至7种不同组分配比液体培养基中，置于37 ℃摇床中200 r/min振荡培养18 h。对各液体培养基的菌液进行平板活菌计数，放37 ℃过夜培养，统计计数结果。1.2.5生长曲线测定将纯培养后的乳房链球菌二级种子液转至大瓶培养基中，37 ℃恒温摇床中200 r/min 振荡培养，从第6 h起，每隔2 h取样进行平板活菌计数，统计计数结果。1.2.6药敏试验取培养的乳房链球菌培养液，每个TSA平板中加入100 µL菌液，并用灭菌棉签涂布均匀；用灭菌镊子夹取30种药敏片分别放置在平板表面。平板倒置于37 ℃恒温箱中培养24 h，测量抑菌圈大小，统计结果。2结果与分析2.1乳房链球菌的分离鉴定2.1.1乳房链球菌在血琼脂平板上的生长情况（见图1）由图1可知，乳房链球菌在血琼脂平板上呈灰白色，圆而微凸，表面光滑，边缘整齐，周围无明显溶血环。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.F001图1乳房链球菌在血琼脂平板上的生长情况Fig.1Growth of Streptococcus uberis on blood agar plates2.1.2乳房链球菌革兰氏染色情况（见图2）由图2可知，挑取单个菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察可见呈链状排列的紫色球菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.F002图2乳房链球菌革兰氏染色情况Fig.2Gram staining of Streptococcus uberis2.1.3乳房链球菌的PCR鉴定（见图3）采用16S rDNA通用引物PCR扩增得到的PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增出1 500 bp左右的目的条带，见图3。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.F003图3乳房链球菌的16S rDNA PCR扩增结果Fig.316S rDNA PCR amplification results of Streptococcus uberis注 ： M为DL2000 Marker，1、2均为乳房链球菌。将PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果与NCBI数据库进行比对，确定分离株为乳房链球菌。2.2乳房链球菌的生化鉴定结果（见表2）由表2可知，与七叶苷、乳糖、甘露糖、山梨糖、甘露醇、松三糖、D-核糖反应均为阳性；与VP、6.5%高盐肉汤、pH值9.6肉汤、棉籽糖、阿拉伯糖、菊糖、甘油、马尿酸盐均不反应。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.T002表2乳房链球菌的生化鉴定结果Tab.2Biochemical identification results of Streptococcus uberis项目结果项目结果VP－阿拉伯糖－七叶苷＋甘露醇＋6.5%高盐肉汤－松三糖＋pH值9.6肉汤－D-核糖＋棉籽糖－菊糖－乳糖＋甘油－甘露糖＋马尿酸盐－山梨糖＋2.3液体培养基的优化结果（见图4）各组培养基培养的乳房链球菌计数结果见图4。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.F004图4不同组分LB培养基培养乳房链球菌的活菌计数结果Fig.4Viable count results of Streptococcus uberis cultured in LB medium with different components由图4可知，比较第1、2、3组的结果，氯化钠少于10 g/L或多于10 g/L，菌数均会减少，且第3组少于第2组，表明氯化钠是乳房链球菌培养中不可缺少的成分，但过量的氯化钠会抑制乳房链球菌的生长。比较第1、4、5组，可知对着蛋白胨含量增加，菌数也相应增加，表明蛋白胨为乳房链球菌提供必需营养，可在一定范围内通过提高蛋白胨的含量达到增菌的目的。比较第1、6、7组，3个组别的菌数差别较小，表明在一定范围内，酵母提取物对乳房链球菌的生长影响较小。因此，通过调整不同组分的含量，可使乳房链球菌产能达到最优化。2.4乳房链球菌生长曲线（见图5）由图5可知，乳房链球菌在18 h时菌数达到顶峰，为3.2×108 CFU/mL；在16~20 h基本保持较高水平；18 h后，菌数呈下降趋势并趋于稳定；22 h开始，菌数基本维持在2.85×108~2.90×108 CFU/mL。在实际生产应用中，根据乳房链球菌的生长曲线，可通过控制菌种及培养时间使培养达到最优化。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.F005图5乳房链球菌生长曲线Fig.5Growth curve of Streptococcus uberis2.5乳房链球菌药敏试验结果（见表3）由表3可知，乳房链球菌对青霉素、羧苄西林、头孢氨苄、头孢唑林等抗生素高度敏感，对丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏菌素B、复方新诺明等抗生素耐药。结合药敏试验结果，临床上出现乳房链球菌感染时可以根据抗生素的使用规定，挑选高度敏感的抗生素，交叉联合用药，降低耐药的风险。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.T003表3乳房链球菌药敏试验结果Tab.3Drug susceptibility test results of Streptococcus uberis项目耐药R中敏I敏感S乳房链球菌青霉素≤1414~15≥1531苯唑西林≤1314~16≥1720氨苄西林≤1314~16≥1720羧苄西林≤1314~16≥1730哌拉西林≤1314~16≥1726头孢氨苄≤1415~17≥1830续表3　乳房链球菌药敏试验结果单位：mm(Continued)Tab.3　Drug susceptibility test results of Streptococcus uberismmXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.T004项目耐药R中敏I敏感S乳房链球菌头孢唑林≤1415~17≥1830头孢拉定≤1415~17≥1825头孢呋辛≤1415~22≥2325头孢他啶≤1415~22≥2323头孢曲松≤1415~22≥2314头孢哌酮≤1415~22≥2324丁胺卡那≤1213~14≥150庆大霉素≤1213~14≥150卡那霉素≤1314~17≥180新霉素≤1314~17≥180四环素≤1415~18≥1923多西环素≤1415~18≥1923米诺环素≤1415~18≥1924红霉素≤1314~22≥2321麦迪霉素≤1314~22≥2320诺氟沙星≤1213~16≥1714氧氟沙星≤1213~15≥1615环丙沙星≤1516~20≥2117万古霉素≤1415~18≥1914多黏菌素B≤89~11≥120复方新诺明≤1516~20≥210呋喃酮≤1415~16≥1719氯霉素≤1213~14≥1521克林霉素≤1415~22≥23203讨论本试验从南京奶牛养殖场分离得到1株疑似链球菌，通过观察菌落形态、革兰氏染色、测序等鉴定为乳房链球菌；并对其生化特性进行研究。在优化培养基配方时，发现在一定范围内，氯化钠过量或者过少均会导致细菌数减少；酵母提取物的含量对菌数影响较有限；而菌数随着蛋白胨含量的增加随之显著增加；表明蛋白胨是乳房链球菌的重要营养成分。研究还测定了乳房链球菌的生长曲线，确定培养16~20 h活菌数最高。因此，在实际生产中，可以进一步探究乳房链球菌的培养组分的配比以及控制培养时长，使生产达到最优化。本研究分离的乳房链球菌对青霉素、羧苄西林、头孢氨苄、头孢唑林等抗生素高度敏感；而对丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、多黏菌素B、复方新诺明等抗生素耐药。马博等[9]发现，新疆石河子地区奶牛乳房炎链球菌对青霉素、克林霉素、多西环素具有较好的耐药性。本研究分离的乳房链球菌与前人试验中分离的乳房链球菌对青霉素的敏感程度差异极大。原因可能是不同地区抗生素用药程序及方式的差异，造成了乳房链球菌的不同耐药性。因此，在奶牛乳腺炎的防控防治中，根据抗生素的使用规定，交叉联合用药，降低耐药的风险也是重要一环。引起乳房炎的因素不局限于乳房链球菌，还包括各种物理因素、化学因素和微生物因素，如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌等[10-11]。多管齐下，才能真正做好奶牛乳房炎的防控。有研究发现，乳房链球菌可以导致奶牛子宫内膜炎的发生，常造成奶牛受孕期延长，屡配不孕，甚至导致淘汰，造成了巨大的经济损失[12-13]。通过筛选乳房链球菌疫苗株，为乳房链球菌疫苗的推出奠定基础，助力乳房炎和子宫内膜炎的防控，减少抗生素的滥用，为乳制品品质提供保障，维护人类健康[14-15]。4结论本试验从生化特征、生长曲线、抗生素敏感性、培养条件优化等方面研究分离得到的乳房链球菌。结果表明，该株乳房链球菌与七叶苷等反应阳性，与棉籽糖等反应阴性。在37 ℃、200 r/min条件下培养16~20 h可达到最高菌数水平。适当增加培养基中蛋白胨的含量可提高该菌的菌数水平。药敏试验表明，该菌对青霉素、羧苄西林、头孢唑林等抗生素高度敏感。上述试验数据可为临床科学使用抗生素、乳房炎疫苗的制备筛选提供参考。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2022.10.006.F006